DNA分子遺傳標記在中藥中的應用

DNA分子遺傳標記

廣義的分子標記（molecularmarker）是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。常用的是狹義的分子標記概念，即DNA分子標記。DNA分子標記主要分為以下三類一、限制性片段長度多態性（RFLP）：是發展最早的分子標記技術，以分子雜交為核心技術。二、DNA序列測定三、基于PCR的分子標記：根據引物的選擇可分為隨機引物擴增和特定序列位點擴增。隨機擴增多態性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。隨機引物擴增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）2、DNA擴增產物指紋分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:與RAPD技術不同的是引物濃度更高，長度更短（5～8個bp），只有2個溫度循環（在RAPD中是3個溫度循環），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、特征擴增區段測序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標RAPD片段進行測序，根據RAPD片段兩末端的序列設計特定引物（一般比RAPD引物長，24bp），再進行PCR擴增，可把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒定出來，可重復性高。RFLP技術及其應用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內切酶切片段長度多態性)是70年代發展起來的DNA片段分析技術。該技術不僅在生物學、醫學、農學的許多領域都有了成功的應用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質量評價方面也有許多應用。基本原理

生物在進化過程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結構重排，造成了分子內核苷酸排列順序的改變，當這種改變涉及到限制性酶切位點時，酶切后產生的DNA片段長度將發生變化，限制性片段的長度在不同個體間呈多態性現象，即稱為限制性片段長度多態(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡稱RFLP)RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCTDNA多態性根據其產生的兩種基本方式堿基對突變類型(基因點突變),即限制性內切酶識別位點上發生了單個堿基替換(轉換或顛換)，使原有切點消失或產生新的切點。結構重排型，這是由DNA內部發生較大的順序變化所引起的。RFLP與鐮狀細胞貧血基本實驗步驟靶DNA的準備核酸探針的標記雜交顯示RFLP的優點及局限性

優點：(1)普遍存在(2)穩定性(3)共顯性(4)探針與限制酶的組合數量無限局限性：（1）用RFLP僅能檢測出影響到限制性內切酶識別位點的突變（2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多（3）RFLP分析技術要求DNA無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別（4）限制性內切酶價格較貴

RFLP用于親緣關系分析“Ladder”RFLP在中藥材鑒別中的應用

（一）近緣種的鑒別如：海馬的PCR-RFLP分析

（二）藥用植物親緣關系的研究如：羽扇豆屬植物系統發育關系及與生物堿分布的關系

RAPD技術及其應用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增多態性DNA)技術是1990年由杜邦公司Williams和Welsh兩個研究小組同時發展起來的一項DNA多態檢測技術。該技術高效、靈敏、簡便、快速，一經出現就被普遍用于物種種屬分類、親緣關系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農作物育種等研究領域。近年，RAPD技術又進入了中藥材的鑒別研究領域，并得到廣泛應用，已成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺傳標記技術。RAPD技術基本原理RAPD的核心技術是PCR反應，但又不同于經典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進行PCR擴增，Williams稱之為RAPD，引物通常為10個堿基；Welsh稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物為20～30個堿基。對于任一引物，如在一定范圍內模板DNA上有與之互補的反向重復序列時，就可擴增出此范圍的DNA片段。RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA基本實驗步驟

模板DNA的制備PCR擴增，通常RAPD擴增條件為：93℃預變性200s，開始如下循環：94℃變性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；經過40個循環后，72℃延伸5min，循環結束后反應產物置于4℃保存。擴增產物20μl反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況RAPD圖譜的數據處理RAPD分析的優越性和不足優越性：(1)無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設計RAPD擴增反應的引物，引物隨機合成或是任意選定的,長度一般為9-10個寡核苷酸；(2)擴增沒有特異性；(3)退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩定配對，同時也允許了適當的錯誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。(4)簡便易行，省力省時。（5）檢測靈敏方便；（6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自動化。不足：（1）重復性不高。RAPD在擴增反應時使用的是低溫復性(通常為36℃),特異性不高,引物與模板間有較高的錯配率,結果容易受到多種因素的影響,不同的實驗室這間有時不能重復；（2）對模板DNA質量要求高，操作要求嚴格，檢驗成本相對較高；（3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增產物；（4）RAPD標記難以區分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。M12345678910111213141516不同Mg2+和dNTP濃度對RAPD帶型的影響123456789101112M不同Taq和Primer濃度對RAPD帶型的影響M12345678910111213

M13141516171819202122232425不同循環量和模板DNA濃度對RAPD帶型的影響

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不同復性溫度對RAPD帶型的影響圖4不同復性溫度對RAPD帶型的影響Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperature

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不同復性溫度對RAPD帶型的影響RAPD分析在中藥研究中的應用

道地藥材的評價

例：當歸藥材道地性的RAPD分析野生與栽培種及不同農家品種親緣關系分析例：人參及山參RAPD指紋動物藥的鑒定

例：蛇類藥材分子遺傳標記鑒別的研究AFLP技術及其應用

擴增酶切片段多態性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術，AFLP是近幾年來繼RFLP、RAPD之后發展最快的DNA分子標記技術。被譽為新一代的分子標記技術，近年來已得到廣泛的應用。AFLP基本原理

AFLP的基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增。先將基因組DNA用限制性酶消化，產生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（artificialadapter）,與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應的模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結合位點。AFLP反應的結果是主要擴增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。基本實驗步驟

模板的制備：即DNA酶切及人工接頭的連接（RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters）限制性片段的選擇性擴增（Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments）擴增產物凝膠電泳分析（Gelanalysisoftheamplifiedfragments）AFLP的實驗過程AFLP反應流程：AFLP反應程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析這3個基本步驟。各步驟具體的過程有：首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個堿基識別位點的限制性內切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶