第四章目的基因的獲得酵母雙雜交詳解演示文稿本文檔共56頁；當前第1頁；編輯于星期六\13點13分優選第四章目的基因的獲得酵母雙雜交本文檔共56頁；當前第2頁；編輯于星期六\13點13分經典文獻出處FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.

Nature,1989,340(6230):245-246二、酵母雙雜交系統的建立本文檔共56頁；當前第3頁；編輯于星期六\13點13分該系統的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。真核生物基因轉錄需要反式轉錄激活因子的參與，真核生長轉錄因子含有兩個不同的結構域：轉錄激活因子DNA結合結構域(BD)(DNAbindingdomain)轉錄激活結構域(AD)(activationdomain)1989年美國紐約州立大學的Fields和Song首先描述了酵母雙雜交系統(yeasttwo-hybridsystem)。本文檔共56頁；當前第4頁；編輯于星期六\13點13分這兩個結構域各具功能，互不影響，單獨存在時沒有轉錄激活的功能，只有兩者通過共價或非共價鍵連接建立起來的空間結構方可表現出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。本文檔共56頁；當前第5頁；編輯于星期六\13點13分目前酵母雙雜交實驗采用的系統有LexA系統和Gal4系統兩種。在LexA系統中，DNA結合域由一個完整的原核蛋白LexA構成，轉錄激活域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42構成，它在酵母中可以活化基因的轉錄;在Gal4系統中，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結構域(1-147aa與768-881aa)構成。本文檔共56頁；當前第6頁；編輯于星期六\13點13分

兩個結構域中的BD由位于N-末端的1～147位多肽構成，能識別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence，UAS)。此外，在其N-端還具有一段核定位序列。AD由位于C-末端的768～881位多肽構成。Gal4的兩個結構域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復Gal4作為轉錄因子的活性。Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。本文檔共56頁；當前第7頁；編輯于星期六\13點13分

Fields和Song將兩個融合蛋白分別構建在穿梭質粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。本文檔共56頁；當前第8頁；編輯于星期六\13點13分當兩種穿梭質粒共轉化含有Gal4結合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個大的復合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應基因的UAS，并可與之結合；Gal4的AD則可與轉錄復合物中其他成分結合，激活UAS下游報告基因LacZ的轉錄。本文檔共56頁；當前第9頁；編輯于星期六\13點13分三、酵母雙雜交系統的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD本文檔共56頁；當前第10頁；編輯于星期六\13點13分許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個在結構上可以分開的、功能上也相互獨立的結構域組成。1.結構域（Domain）合作本文檔共56頁；當前第11頁；編輯于星期六\13點13分例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉錄激活GAL4效應基因結合結合激活轉錄實驗發現：轉錄表達只要DNAbindingdomain（DNA-BD）與Activedomain（AD）靠近就能激活轉錄。本文檔共56頁；當前第12頁；編輯于星期六\13點13分2.拆開DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）轉錄激活GAL4效應基因結合用重組DNA技術把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應基因的能力。不能轉錄本文檔共56頁；當前第13頁；編輯于星期六\13點13分3.重組Domain用重組DNA技術把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在體內，蛋白A與蛋白B是否能結合。4.觀察報告基因表達本文檔共56頁；當前第14頁；編輯于星期六\13點13分GAL4的BDdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應基因的轉錄。（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結合（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結合上游激活序列（UAS）轉錄激活GAL4效應基因蛋白ADNAbindingdomain轉錄激活domain蛋白B激活轉錄轉錄表達本文檔共56頁；當前第15頁；編輯于星期六\13點13分X基因和Y基因產物的相互結合，導致reportergene表達。Reportergene表達就說明X基因產物與Y基因產物能結合。雙雜交原理本文檔共56頁；當前第16頁；編輯于星期六\13點13分本文檔共56頁；當前第17頁；編輯于星期六\13點13分酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統具有許多優點:易于轉化、便于回收擴增質粒具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報告基因酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結合報道株經改造的、含報告基因的重組質粒的宿主細胞本文檔共56頁；當前第18頁；編輯于星期六\13點13分基因組中GAL4基因是缺失型的基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS改造后的酵母細胞的特點：通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落本文檔共56頁；當前第19頁；編輯于星期六\13點13分

表達“誘餌”和“獵物”蛋白；檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因。做法：首先構建能表達“誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。該載體中可加入進行營養型篩選的基因。四、酵母雙雜交系統的基本策略本文檔共56頁；當前第20頁；編輯于星期六\13點13分五、酵母雙雜交系統的優點高敏感性。原因：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物，之后又與啟動子結合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結合更趨于穩定；③通過mRNA使信號放大；④檢測的結果是基因表達產物的累積效應，可檢測存在于蛋白質間的微弱或暫時的相互作用。本文檔共56頁；當前第21頁；編輯于星期六\13點13分五、酵母雙雜交系統的優點2.真實性。檢測在活細胞內進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內的真實情況。3.簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質的繁瑣步驟。4.廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質，適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。本文檔共56頁；當前第22頁；編輯于星期六\13點13分

分析已知蛋白之間的相互作用對蛋白質功能域的分析，如可將待測蛋白質進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。用已知功能蛋白質篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑，發現新基因。分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據篩的已知基因推測新基因功能。繪制蛋白質相互作用系統圖譜在藥物設計中的應用六、酵母雙雜交系統的應用現狀本文檔共56頁；當前第23頁；編輯于星期六\13點13分1.利用酵母雙雜交發現新的蛋白質與蛋白質的新功能將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯系。本文檔共56頁；當前第24頁；編輯于星期六\13點13分

利用酶聯免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細胞的環境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用。而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。2.利用酵母雙雜交在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用本文檔共56頁；當前第25頁；編輯于星期六\13點13分3.利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

對于能夠引發疾病反應的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。本文檔共56頁；當前第26頁；編輯于星期六\13點13分4.利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（GenomeProteinLinkageMap）基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯系。通過基因組的測序和序列分析發現了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。本文檔共56頁；當前第27頁；編輯于星期六\13點13分七、酵母雙雜交系統中常見問題的解決和改進措施（一）假陽性較多（二）轉化效率偏低（三）陰性干擾本文檔共56頁；當前第28頁；編輯于星期六\13點13分假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一）假陽性較多

①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結合，則可單獨激活報告基因的表達。③AD融合蛋白直接與轉錄因子作用激活報告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。原因：本文檔共56頁；當前第29頁；編輯于星期六\13點13分排除假陽性的措施

①作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區各不相同。目前試劑公司已采用。③報告基因整合到染色體上，可使基因表達水平穩定。④優化3-AT(3-aminotriazole，3-氨基三唑

)濃度。適當增加濃度可減少假陽性。本文檔共56頁；當前第30頁；編輯于星期六\13點13分進一步分析：①這種相互作用是否會在細胞內自然發生。②有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。③一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發生相互作用。排除假陽性的措施本文檔共56頁；當前第31頁；編輯于星期六\13點13分原因：由于酵母轉化效率較細菌低4個數量級，因此轉化成為雙雜交技術的重要瓶頸。解決辦法：引進酵母接合型

a接合型和接合型（兩者之間可形成二倍體，但自身不能）（二）轉化效率偏低本文檔共56頁；當前第32頁；編輯于星期六\13點13分接合型酵母細胞cDNA文庫誘鉺蛋白基因多克隆位點DNA-BD載體AD載體轉化轉化a接合型酵母細胞篩選平板生長菌苔篩選平板生長菌苔同一個三重篩選平板克隆（誘餌與靶蛋白相互作用）鑒定β-半乳糖苷酶部分已商品化本文檔共56頁；當前第33頁；編輯于星期六\13點13分（三）陰性干擾融合蛋白的表達對細胞有毒性，該怎么辦？應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數低的載體蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩定地表達，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉入胞核。兩個蛋白本應發生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。原因：本文檔共56頁；當前第34頁；編輯于星期六\13點13分

酵母雙雜交系統是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應用，但仍存在一些局限性。八、酵母雙雜交系統使用注意事項本文檔共56頁；當前第35頁；編輯于星期六\13點13分酵母雙雜交系統局限性某些誘餌蛋白具有自身激活性質。---------雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域某些蛋白在酵母中不穩定表達或不能準確定位到胞核內。在細胞表面發生的相互作用可采用噬菌體顯示系統。

雙雜交系統分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應在核內無法進行。

本文檔共56頁；當前第36頁；編輯于星期六\13點13分酵母雙雜交系統局限性有時DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。4.哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的環境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究。雙雜交系統的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。本文檔共56頁；當前第37頁；編輯于星期六\13點13分

在酵母雙雜交的基礎上，又發展：酵母單雜交--用于核酸和文庫蛋白之間的研究酵母三雜交--三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交--兩種蛋白相互作用的結構和位點。反向雙雜交系統和三雜交技術本文檔共56頁；當前第38頁；編輯于星期六\13點13分(一)酵母單雜交系統(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相繼創立發展出一種研究蛋白質和DNA相互作用的實驗體系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文獻出處本文檔共56頁；當前第39頁；編輯于星期六\13點13分酵母單雜交系統原理在酵母單雜交系統中，省略了在酵母雙雜交系統中采用的BD-X蛋白質雜交體，而用特異的DNA序列取代DNAGal4結合位點。該DNA序列在相關生物系統中是重要的蛋白質結合位點。靶DNA序列特異的結合蛋白(BDPX)與Gal4P的激活結構域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結合位點之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標志的報告基因的表達。本文檔共56頁；當前第40頁；編輯于星期六\13點13分酵母單雜交系統原理理論上，酵母單雜交系統可利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結合的結構域的蛋白質。該系統不僅適用于識別轉錄因子，也適用于研究參與轉錄抑制和DNA復制過程的蛋白質。本文檔共56頁；當前第41頁；編輯于星期六\13點13分酵母單雜交系統應用①確定已知DNA-蛋白質之間是否存在相互作用。②分離編碼結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因。③定位已經證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。

----研究DNA-蛋白質相互作用本文檔共56頁；當前第42頁；編輯于星期六\13點13分(二)反向酵母雙雜交系統

（reverseyeasttwo-hybridsystem）1996年，Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.本文檔共56頁；當前第43頁；編輯于星期六\13點13分(二)反向酵母雙雜交系統

（reverseyeasttwo-hybridsystem）該系統是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術，核心在于構建一種反向篩選的報告基因。在這系統中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種毒性標志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關的小分子物質。本文檔共56頁；當前第44頁；編輯于星期六\13點13分反向雙雜交系統基本原理示意圖本文檔共56頁；當前第45頁；編輯于星期六\13點13分反向雙雜交系統基本原理示意圖雙雜交產生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽性篩選標志His3的表達，此時野生型相互作用使宿主細胞表現為組氨酸營養缺陷型。