第三節多肽和蛋白質類藥物的生產演示文稿本文檔共51頁；當前第1頁；編輯于星期六\10點8分優選第三節多肽和蛋白質類藥物的生產本文檔共51頁；當前第2頁；編輯于星期六\10點8分本文檔共51頁；當前第3頁；編輯于星期六\10點8分本文檔共51頁；當前第4頁；編輯于星期六\10點8分1.干擾素概述干擾素的種類干擾素的理化性質干擾素的生物學活性干擾素的臨床應用干擾素的生產工藝路線本文檔共51頁；當前第5頁；編輯于星期六\10點8分1.1干擾素的種類概念：（interferon，IFN）干擾素是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒應答反應，而產生的一組結構類似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名稱為Interferon，簡稱IFN。發現：干擾素是1957年英國科學家Isaccs等發現的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細胞，結果發現這些細胞產生了一種可溶性物質，這種物質能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質稱為“干擾素”。以后科學家們進一步發現，機體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產生干擾素以進行防御。當機體細胞受到病毒感染時，機體細胞產生干擾素，干擾病毒復制，它是機體抗病毒感染的防御系統。

本文檔共51頁；當前第6頁；編輯于星期六\10點8分天然干擾素分類1.根據來源、基因序列和氨基酸組成分類

I型干擾素：

IFNα、IFNβ、IFNτ、IFN

ω

來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等

功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長

免疫調節(較弱）

其中IFN-α為多基因產物，有23種以上的亞型。

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來源：活化的T細胞和NK細胞產生

功能：免疫調節提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性抑制TH2細胞形成，下調體液免疫應答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據動物來源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。

本文檔共51頁；當前第7頁；編輯于星期六\10點8分上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我國第一個基因工程藥物IFN-α1b獲得國家一類新藥證書。研發中的重組干擾素：IFNω，臨床階段本文檔共51頁；當前第8頁；編輯于星期六\10點8分1.2干擾素的理化性質143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質。本文檔共51頁；當前第9頁；編輯于星期六\10點8分Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應不是直接的，而是通過對宿主細胞的作用引起的。①對干擾素敏感的細胞表面存在于干擾素受體，核內有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進病毒mRNA降解。②干擾素能提高細胞表面MHCⅠ類分子的表達水平，受到病毒感染的細胞表面MHCⅠ類分子的增加有助于向Tc細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解。③干擾素可增強NK細胞對病毒感染的殺傷能力。1.3干擾素的生物學活性正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細胞產生干擾素。廣譜抗病毒活性機制本文檔共51頁；當前第10頁；編輯于星期六\10點8分病毒復制抑制病毒復制信號轉導IFN-aIFN-誘導蛋白誘導刺激胞核胞核本文檔共51頁；當前第11頁；編輯于星期六\10點8分抗腫瘤作用機制Ⅰ型干擾素能抑制細胞的DNA合成，減慢細胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的作用比對正常細胞的作用強

500～1000倍。另外，Ⅱ型干擾素也可通過增強機體免疫機制、加強免疫監督功能來實現其抗腫瘤效應。本文檔共51頁；當前第12頁；編輯于星期六\10點8分免疫調節活性機制

免疫調節作用表現在對宿主免疫細胞活性的影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有一定作用。對巨噬細胞的作用：IFNγ可使巨噬細胞表面MHCⅡ類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。對淋巴細胞的作用：干擾素對淋巴細胞的作用較為復雜，可受劑量和時間等因素的影響而產生不同的效應。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或將干擾素與抗原同時投入會產生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFNγ對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，但不能促進其增殖。IFNγ能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能；但對TH2細胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH2細胞產生IL-4，而且抑制IL-4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE。對其它細胞的作用：IFNγ對其他細胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細胞，增強其吞噬能力；②活化NK細胞，增強其細胞毒作用；③使某些正常不表達MHCⅡ類分子的細胞（如血管內皮細胞、某些上皮細胞和結締組織細胞）表達MHCⅡ類分子，發揮抗原遞呈作用；④使靜脈內皮細胞對中性粒細胞的粘附能力更強，且可分化為高內皮靜脈，吸引循環的淋巴細胞。本文檔共51頁；當前第13頁；編輯于星期六\10點8分1.4重組干擾素的臨床應用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調節活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發性硬化癥rhuIFNβ本文檔共51頁；當前第14頁；編輯于星期六\10點8分1.5.干擾素生產工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性本文檔共51頁；當前第15頁；編輯于星期六\10點8分干擾素生產工藝路線（2）人源轉化細胞系培養生產工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優點：首次實現大規模商業化生產。缺點：活性低，退出臨床應用。本文檔共51頁；當前第16頁；編輯于星期六\10點8分干擾素生產工藝路線（3）上市產品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發酵過程，隨后變性、復性過程。基因工程大腸桿菌發酵生產工藝:本文檔共51頁；當前第17頁；編輯于星期六\10點8分干擾素生產工藝路線（4）上市產品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達產物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產量低，成本高,過程嚴格動物無限細胞系培養生產工藝：本文檔共51頁；當前第18頁；編輯于星期六\10點8分干擾素生產工藝路線（5）?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）?上市產品：IFNα-2b/安福隆?表達產物：無糖基化可溶性蛋白質，具有天然分子結構和生物活性?工藝特點：發酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產品純化過程：淘汰抗體親和層析基因工程假單胞桿菌發酵生產工藝本文檔共51頁；當前第19頁；編輯于星期六\10點8分2.基因工程假單胞桿菌的構建與保藏

基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫的建立與保藏本文檔共51頁；當前第20頁；編輯于星期六\10點8分2.1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構建第三步：工程菌的構建本文檔共51頁；當前第21頁；編輯于星期六\10點8分第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR)

制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質粒,轉化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。本文檔共51頁；當前第22頁；編輯于星期六\10點8分第二步：表達載體構建?IFN基因與表達載體連接?轉化大腸桿菌?篩選陽性克隆?獲得序列正確表達載體本文檔共51頁；當前第23頁；編輯于星期六\10點8分第三步：工程菌構建轉化假單胞桿篩選高表達、穩定遺傳的工程菌獲得原始菌種本文檔共51頁；當前第24頁；編輯于星期六\10點8分2.2基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：細菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產干擾素能力：放射性免疫學效價不低于2.0×109IU/L。本文檔共51頁；當前第25頁；編輯于星期六\10點8分2.3菌種庫的建立與保藏?QC：菌種特性、生產能力、質粒穩定性?菌種檢查合格后，方可投產。本文檔共51頁；當前第26頁；編輯于星期六\10點8分

3.干擾素α-2b的發酵工藝過程本文檔共51頁；當前第27頁；編輯于星期六\10點8分3.1搖瓶培養取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發酵液雜菌檢查。本文檔共51頁；當前第28頁；編輯于星期六\10點8分3.2種子罐培養

接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養：30℃，pH7.0。控制：級聯調節通氣量和攪拌轉速DO為30%，3～4h，OD>4.0。檢測：顯微鏡和LB培養基劃線檢查，控制雜菌。本文檔共51頁；當前第29頁；編輯于星期六\10點8分

3.3發酵罐培養接種：通入300L培養基的發酵罐，接種量10%。控制：級聯調節通氣量和攪拌轉速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發酵液雜菌檢查本文檔共51頁；當前第30頁；編輯于星期六\10點8分3.4．菌體收集連續流離心機：冷卻的發酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩定性。本文檔共51頁；當前第31頁；編輯于星期六\10點8分4干擾素的分離純化工藝過程4.1、干擾素分離工藝過程

4.2、干擾素的純化工藝過程本文檔共51頁；當前第32頁；編輯于星期六\10點8分4.1干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理初級分離本文檔共51頁；當前第33頁；編輯于星期六\10點8分(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。本文檔共51頁；當前第34頁；編輯于星期六\10點8分(2)預處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。本文檔共51頁；當前第35頁；編輯于星期六\10點8分(3)離心

連續流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質雜質沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。本文檔共51頁；當前第36頁；編輯于星期六\10點8分（4）初級分離

鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。本文檔共51頁；當前第37頁；編輯于星期六\10點8分4.2、干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝本文檔共51頁；當前第38頁；編輯于星期六\10點8分(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：

2℃～10℃，勻漿，完全溶解。本文檔共51頁；當前第39頁；編輯于星期六\10點8分(2)沉淀與疏水層析

等電點沉淀（1）：磷酸調節至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。本文檔共51頁；當前第40頁；編輯于星期六\10點8分等電點沉淀（2）：磷酸調節pH4.5，調節電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。本文檔共51頁；當前第41頁；編輯于星期六\10點8分(3)陰離子交換層析與濃縮0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。濃縮：調整溶液和電導，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。本文檔共51頁；當前第42頁；編輯于星期六\10點8分（4)陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。本文檔共51頁；當前第43頁；編輯于星期六\10點8分(5)凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統和樹脂上樣，相同緩沖液進行洗脫。合并干擾素部分本文檔共51頁；當前第44頁；編輯于星期六\10點8分(6)無菌過濾分裝0.22μm濾膜