第七章干細胞第一節干細胞概述第二節胚胎干細胞的研究第三節成體干細胞的研究第四節在再生醫學中的應用第七章干細胞第一節干細胞概述1第一節干細胞概述

一、干細胞（stemcell）的概念二、干細胞的特征三、干細胞的分類四、干細胞分化發育的途徑

五、細胞因子

第一節干細胞概述一、干細胞（stemcell）的概2一、干細胞概念

具有自我更新、高度增殖能力的細胞，能產生表現型和基因型和自己完全相同的子細胞，同時還能分化為祖細胞。即這些細胞可以通過細胞分裂維持細胞群的大小，同時又可以進一步分化成各種不同的組織細胞，從而構成有機體各種復雜的組織和器官。

一、干細胞概念具有自我更新、高度增殖能力的細胞，3二、干細胞的一般特性發育的全能性或多能性無限的自我更新能力長的生命周期及相對慢的增殖速度極強的再生能力易操作性

二、干細胞的一般特性發育的全能性或多能性41、發育的全能性或多能性

ES細胞具有發育全能性，適當條件下，在體外長期培養或凍存，也不影響。小鼠ES在實驗室已培養10多年。人類ES細胞在體外已傳代250代。組織干細胞以前一直以為只能分化出來源組織的細胞類型，目前的研究已發現可分化成來源以外組織的細胞。如骨髓間質干細胞，可分化為星形膠質細胞、神經細胞、少突膠質細胞、血細胞、肝細胞、肌細胞等。但多數組織干細胞是單能性的，如生精干細胞。1、發育的全能性或多能性

ES細胞具有發育全能性，適當條件下52、無限的自我更新能力

成體組織的干細胞群相對穩定，干細胞通過不對稱分裂方式在完成組織細胞更新補充的同時，也使干細胞池保持穩定。如果在干細胞水平出現DNA復制錯誤，這些變異的遺傳信息將隨著不對稱分裂而擴大到整個干細胞群，導致異常分化和細胞功能紊亂。2、無限的自我更新能力成體組織的干細胞群相對穩定，干細胞通63、長的生命周期及相對慢的

增殖速度

不同組織干細胞自我更新速度不同，如小腸和造血系統的上皮細胞更新速度較快，約12小時。但肝干細胞只在受損傷較重的情況下，才激活和分裂。神經干細胞長期存在在神經組織中，不知道它的功能是什么。在機體穩定狀態下，組織細胞數量的保持和補充主要是定向祖細胞。干細胞只是在必要時分裂補充定向祖細胞。相對祖細胞，干細胞分裂速度慢。3、長的生命周期及相對慢的

增殖速度不同組織干細胞自我更新74、極強的再生能力

多數干細胞都有參與組織再生和修復的能力。個別干細胞如神經干細胞在體外誘導實驗中具有分化潛力，但在體內，就沒有這個能力，認為缺乏干細胞分化的環境和條件，所以中樞神經系統損傷后不能修復。4、極強的再生能力多數干細胞都有參與組織再生和修復的能力。8

5、易操作性干細胞容易在體外培養，為各種遺傳操作創造了條件。如基因轉移、基因打靶等都不影響干細胞的發育潛力。如利用ES細胞做為外源基因的載體。5、易操作性干細胞容易在體外培養，為各種遺傳操作創造了條件9三、干細胞的分類

以細胞分化能力來分：1、單能干細胞2、多能干細胞3、全能干細胞以細胞來源分：1、胚胎干細胞（ES、EG）2、組織干細胞（成體干細胞）三、干細胞的分類

以細胞分化能力來分：101、單能干細胞只能向一種細胞分化或密切相關的兩類細胞分化。如皮膚上皮干細胞。這個概念以后是否能存在？1、單能干細胞只能向一種細胞分化或密切相關的兩類細胞分化。如112、多能干細胞（pluripotentstemcell）

具有分化出多種組織細胞的潛能，但不能形成完整有機體。如小腸干細胞可分化為上皮細胞、腺細胞等。骨髓造血干細胞可形成12種細胞。2、多能干細胞（pluripotentstemcell）123、全能干細胞（totipotentstemcell）能分化成各種細胞，形成一個完整的有機體潛能。如受精卵和胚胎干細胞。

3、全能干細胞（totipotentstemcell）13四、

干細胞分化發育的途徑

干細胞——定向祖細胞——分化細胞四、干細胞分化發育的途徑

干細胞——定向祖細胞——分化細14干細胞具有無限的自我更新能力，但分裂不頻繁，數量保持穩定。定向祖細胞增殖能力有限，有一定的分化潛力，是干細胞最終形成某種分化細胞的祖先細胞（progenitorcell）。分化細胞的分化標記基因全部表達，沒有繼續分裂能力，壽命較短。也有例外如神經細胞壽命長。

干細胞具有無限的自我更新能力，但分裂不頻繁，數量保持穩定。15

干細胞祖細胞分化細胞是否表達分化標記蛋白沒有開始具備有增殖能力無限有無自我更新能力無限無無產生分化后代的能力有有限無參與受損組織的再生能力長期有暫時有無

再生和干細胞課件16五、干細胞不對稱分裂

不對稱分裂：干細胞分裂產生2個細胞，1個為干細胞，另一個為祖細胞，然后由祖細胞產生分化細胞。如多數無脊椎動物。對稱分裂（群體不對稱分裂）：從單個干細胞看，干細胞分裂產生2個細胞，或者都是干細胞，或者都為祖細胞，為對稱分裂。但從干細胞群體看，平均每個干細胞仍為不對稱分裂，如哺乳動物。五、干細胞不對稱分裂不對稱分裂：干細胞分裂產生2個細胞，117六、細胞因子與干細胞微環境

細胞因子在傳遞細胞與胞外基質間、細胞與細胞間的信息中起重要作用。細胞因子有干細胞因子（SCF）、白細胞介素(ILs)、干細胞生長因子(CSF)、表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等。六、細胞因子與干細胞微環境

細胞因子181999年Goodell分離出小鼠肌干細胞，體外培養5天后，與少量的骨髓間質細胞一起移植入小鼠中，結果肌干細胞分化為各種血細胞。這個現象稱為干細胞橫向分化，認為是周圍環境影響的結果。干細胞微環境（干細胞壁戶，Niche）對細胞分化起很重要的調控作用

1999年Goodell分離出小鼠肌干細胞，體外培養5天后，19第二節

胚胎干細胞的研究一、胚胎干細胞的概念二、胚胎干細胞的研究歷史三、胚胎干細胞的分離培養、建系技術四、定向誘導分化五、胚胎干細胞系基本特征第二節

胚胎干細胞的研究一、胚胎干細胞的概念20一、胚胎干細胞的概念從早期胚胎內細胞團（innercellmass,ICM）（大約140個細胞）分離來的（ES細胞）或從生殖嵴分離的原生殖細胞（EG細胞），經體外抑制分化培養，所獲得的具有保持未分化狀態的無限增殖能力的細胞，這些細胞在適宜的條件下，能夠分化成各種類型的細胞、組織。一、胚胎干細胞的概念從早期胚胎內細胞團（innercell21二、胚胎干細胞的研究歷史

20世紀80年代初，英國劍橋大學Evans和Kaufman以及美國Martin實驗室獨立從小鼠囊胚分離可在體外培養的正常干細胞，名為EK細胞。開創了ES細胞生物學研究的新時代。在此后胚胎干細胞在其他動物的分離和建系卻受挫折，到80年代后期才有所突破。20世紀90年代美國Matsui等從小鼠9天的胚胎生殖嵴建立了生殖細胞系，稱EG細胞系，以后其他動物也相繼建立ES和EG細胞系。1998年美國威斯康星大學的Thomson等利用36枚新鮮或凍存的人工體外受精的胚胎，獲得人的ICM細胞，建立了5株ES細胞系，以后從流產的胎兒培養出EG細胞系。這兩個細胞系的建立和應用可能涉及社會和倫理問題，應當引起重視。1981-2000年，建立豬、牛、兔、綿羊、山羊、魚、倉鼠、恒訶、河猴、人ES細胞系。二、胚胎干細胞的研究歷史

20世紀80年代初，英國22三、胚胎干細胞的培養、建系技術

1、抑制分化培養2、ES細胞的分離培養3、EG細胞的分離培養三、胚胎干細胞的培養、建系技術

1、抑制分化培養231、抑制分化培養由于早期細胞離體后極易發生分化，所以首先阻止其分化，確保全能性是關鍵。細胞分化抑制物是飼養層細胞、條件培養基和分化抑制因子，抑制分化培養方法有2種。1）飼養層細胞培養法2）無飼養層細胞培養法1、抑制分化培養由于早期細胞離體后極易發生分化，所以首先阻止24飼養層培養法分離的細胞生長在小鼠飼養層上（一種用射線照射或者加入有絲分裂抑制劑如用絲裂霉素處理的成纖維細胞層，成纖維細胞不能分裂，但能分泌LIF）。

操作比較麻煩，但成功率高，是早期培養的首選方法。飼養層培養法分離的細胞生長在小鼠飼養層上（一種用射線照射或者25無飼養層培養法在培養基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素6或條件培養基如2-3周齡幼年大鼠心肌細胞條件培養液。無飼養層培養法在培養基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素262、ES細胞的分離培養基本培養液：15%-20%小牛血清、0.1mmol/l旈基乙醇和雙抗的DMEM液。將囊胚接種到鋪有飼養層的培養皿中，培養2-3天分離ICM細胞。

免疫手術法常規培養法2、ES細胞的分離培養基本培養液：15%-20%小牛血清、0273、EG細胞的分離培養

在解剖鏡下取生殖嵴，接種到飼養層細胞上，細胞分裂增殖，消化后再培養。3、EG細胞的分離培養

在解剖鏡下取生殖嵴，接種到飼養層細胞28

四、定向誘導分化細胞誘導分化是細胞與其微環境相互間復雜而精密協調的分子細胞學過程。60年代已知誘導現象。譜系分化：經過譜系祖細胞、譜系定型細胞和終末分化細胞的分化全過程。會出現不穩定的過渡細胞。用于基礎研究。定向分化：控制ES細胞定向產生單一類型的終末分化細胞。用于細胞移植和治療。定向誘導的體細胞有：造血細胞、內皮細胞、神經細胞、肝細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、生殖細胞。

四、定向誘導分化細胞誘導分化是細胞與其微環境相互間復雜而精29

四、定向誘導分化誘導物有兩類：1、誘導細胞可逆性的輕度損傷。如無機物、有機酸、醇、氨水或缺鈣的鹽水等。滲透壓改變，造成神經細胞分化。2、與被誘導的細胞表面受體結合而介導的細胞分化。類固醇激素、多肽生長因子。誘導物濃度、時間、作用模式可導致不同分化，非常復雜，定向誘導是胚胎干細胞研究的熱門話題。

四、定向誘導分化誘導物有兩類：30五、胚胎干細胞系基本特性體外無限增殖體外產生分化細胞體內產生畸胎瘤巢狀生長，有多能胚胎干細胞分子標記染色體數目和核型正常遺傳可操作性形成嵌合體實現種系傳遞五、胚胎干細胞系基本特性體外無限增殖31第四節組織干細胞（成體干細胞）

一、組織干細胞概述二、表皮干細胞（ESCs）三、骨髓干細胞四、神經干細胞五、成肌細胞

六、肝干細胞七、成體干細胞研究中存在的問題3第四節組織干細胞（成體干細胞）

一、組織干細胞概述332一、組織干細胞概述1、概念2、對組織干細胞的認識一、組織干細胞概述1、概念331、概念

一群分布在成體組織中未分化的具有自我更新潛能的并負有構建和補充某種組織的各種類型的細胞的干細胞。1、概念一群分布在成體組織中未分化的具有自我更新潛34對成體干細胞的認識傳統觀念：人體除血液、皮膚、消化管和肝有再生能力，其他組織沒有再生能力；成體干細胞是專能的，只屬于某種組織，即造血干細胞只能形成血細胞。最新研究：成體干細胞的發育潛能可跨越組織和胚層界限如小鼠神經干細胞移植到經射線照射的骨髓，分化出血液細胞。此后發現可分化為肌細胞。表明微環境的改變，造成分化潛能的改變。對成體干細胞的認識傳統觀念：人體除血液、皮膚、消化管和肝有再35二、表皮干細胞ESCsESCs的概念ESCs的生物學特征ESCs的鑒別與分離方法二、表皮干細胞ESCsESCs的概念36再生和干細胞課件37再生和干細胞課件38

ESCs的概念

存在于表皮內，一生均保持有增殖能力，可增殖分化為表皮中各種類型的細胞。從再生能力角度：表皮中有表皮干細胞、短暫增殖細胞或祖細胞(transitamplifying，TA)、有絲分裂后(post-mitoticdifferentiating，PMD)細胞。

ESCs的概念

存在于表皮內，一生均保持有增殖能力，可增殖39ESCs的生物學特征

自我更新增殖能力慢周期性對基底膜的黏附作用形態學特點定位

ESCs的生物學特征自我更新增殖能力40在體內表現為可增殖分化形成表皮的全層并維持自身的數量，在體外則表現為克隆性生長。自我更新增殖能力

在體內表現為可增殖分化形成表皮的全層并維持自身的數量，在體外41慢周期體內表現為標記滯留細胞（label-retainingcell,LRC）。在新生動物細胞分裂活躍時摻入氚標記的胸苷，細胞在DNA合成的過程中攝取標記的核苷酸而將標記整合到

DNA中，由于干細胞分裂緩慢，這樣的標記可以維持相當長的一段時間，因而可長期探測到放射性活性，如小鼠表皮干細胞的滯留標記可長達兩年。

慢周期體內表現為標記滯留細胞（label-retaining42對基底膜的黏附作用

干細胞主要通過表達整合素實現對基底膜各種成分的粘附。各種整合素作為受體分子與基底膜各種成分相應的配體結合，如與層黏連蛋白結合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β4，與纖連蛋白結合的有整合素α3β1，與膠原結合的有整合素α2β1。干細胞與基底膜粘附是干細胞維持其特性的基本條件。

對基底膜的黏附作用干細胞主要通過表達整合素實現對基底膜各種43形態學特點

超微結構均具有未分化細胞的特征；細胞體積小，細胞內細胞器稀少，RNA含量低，在組織結構中位置相對固定。形態學特點

超微結構均具有未分化細胞的特征；細胞體積小，細胞44定位定位隱蔽、安全，血供豐富，營養好。在沒有毛發的表皮組織，ESCs與祖細胞（TA細胞）在表皮基底層呈片狀分布，約占基底細胞總數的1%～10%。定位定位隱蔽、安全，血供豐富，營養好。在沒有毛發的表皮組織，45

ESCs的鑒別與分離方法

標記滯留細胞分析法克隆分析法細胞膜表面標志物–整合素

細胞內標志物-角蛋白K15、K19

ESCs的鑒別與分離方法

標記滯留細胞分析法46三、骨髓干細胞造血干細胞間質干細胞三、骨髓干細胞造血干細胞47造血干細胞

骨髓中造血干細胞是各種血細胞的前體細胞。因為細胞表面存在一些標志物，可運用流式細胞儀和磁性分選技術從骨髓中分離到足夠數量的造血干細胞。若移植到不同的體內環境中，形成各種類的細胞。外周血干細胞和臍血干細胞可取代骨髓移植。造血干細胞骨髓中造血干細胞是各種血細胞的前體細胞。因為細胞48再生和干細胞課件49間質干細胞

能分化為成肌細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、肌細胞等，對組織修復應用前景較好。間質干細胞

能分化為成肌細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞50四、成肌細胞骨骼肌干細胞位于肌纖維周圍，稱肌衛星細胞。參與骨骼肌的修復。體外培養發現還能產生血液的成分以及神經元和神經膠質細胞，具分化的可塑性。四、成肌細胞骨骼肌干細胞位于肌纖維周圍，稱肌衛星細胞。參與骨51骨骼肌修復過程1、受損（凍傷、缺血等）的肌纖維出現程度不同的壞死；2、巨噬細胞吞噬清除壞死細胞，但基底膜保留下來；3、成肌細胞在一周內大量分裂，數量達到高峰；4、成肌細胞沿殘留的基底膜與合成肌小管，并分泌肌原纖維為幼稚的肌細胞；5、在微環境的作用下，逐漸成熟。骨骼肌修復過程1、受損（凍傷、缺血等）的肌纖維出現程度不同的52骨骼肌再生的條件基底膜的完整性；受損肌肉的血供重建；受損肌肉的神經支配。骨骼肌再生的條件基底膜的完整性；53五、神經干細胞

胚胎階段神經干細胞位于大腦皮層、小腦等，成體中位于腦室的室管膜。單個室管膜細胞可形成神經細胞、神經膠質細胞等。但由于缺乏足夠的正向刺激信號，神經干細胞無法產生大量的新生神經細胞。有人提出神經干細胞極少的分裂與記憶的形成和整合有關。在外界條件刺激下，如照射，神經干細胞能分化出各種血細胞。五、神經干細胞

胚胎階段神經干細胞位于大腦皮層、小腦等，成體54六、肝干細胞位于門管周圍的卵圓形細胞，具卵圓形細胞核，細胞質少。骨髓中也可見卵圓形細胞，并能分化為肝細胞。六、肝干細胞位于門管周圍的卵圓形細胞，具卵圓形細胞核，細胞質55七、成體干細胞研究中的問題異質性干細胞所處的環境可塑性的調控分化細胞的功能體外的增殖七、成體干細胞研究中的問題異質性56異質性

由于不同遺傳機制而產生相同或類似的表型。是干細胞固有特性。如造血干細胞。肌干細胞能分化出肌肉和血細胞，其實是含有兩類分化方向完全不同的干細胞所致。可塑性是否存在？異質性

由于不同遺傳機制而產生相同或類似的表型。是干細胞固有57干細胞所處的環境

微環境：能容納一個或多個干細胞并能控制其自我更新和分化的組織細胞和胞外基質的組合。是由各種調控活性成分組成的空間，細胞間保持的距離以及局部的近距離的調控正適合于細胞間的相互作用。是干細胞具有可塑性的重要原因之一。干細胞所處的環境

微環境：能容納一個或多個干細胞并能控制其自58可塑性的調控

對可塑性現象的解釋：機體中存在多種來源和不同分化方向的干細胞群，分別定向分化為來源地的組織。機體中存在多能干細胞，在不同微環境的刺激下，向不同組織方向分化。特殊信號刺激，可重新編程，改變分化方向。兩種不同來源的干細胞融合，形成其他組織類型的細胞。可塑性的調控

對可塑性現象的解釋：59在內源性調控機制研究中，一般認為轉錄因子在其中起重要作用。在內源性調控機制研究中，一般認為轉錄因子在其中起重要作用。60分化細胞的功能

檢測終末分化細胞的特定蛋白或標記的表達，很少研究分化細胞的功能。如帕金森病的研究，確實把體外培養的多巴胺能神經元植入腦內，可觀察到被整合到腦組織，但不能證明這些神經元是否具完整的功能。分化細胞的功能

檢測終末分化細胞的特定蛋白或標記的表達，很少61體外的增殖

尚沒有成功的體外較長期保持未分化狀態并能增殖的方法。分離干細胞直接移植體內，在受損部位分化。體外誘導成成熟細胞，然后移植到受傷部位。上述兩者都不成功。體外的增殖

尚沒有成功的體外較長期保持未分化狀態并能增殖的方62第四節在再生醫學中的應用（自學）哺乳類發育的體外模型介導改造動物的基因人體的基因和細胞治療組織工程的種子細胞來源第四節在再生醫學中的應用（自學）哺乳類發育的體外模型63參考文獻張紅衛主編，發育生物學（第2版）高等教育出版社。參考文獻張紅衛主編，發育生物學（第2版）高等教育出版社。64討論題1、3種表皮干細胞檢測方法2、胚胎干細胞建系過程及關鍵技術3、2種造血干細胞分離方法討論題1、3種表皮干細胞檢測方法65再生和干細胞課件66再生和干細胞課件67第七章干細胞第一節干細胞概述第二節胚胎干細胞的研究第三節成體干細胞的研究第四節在再生醫學中的應用第七章干細胞第一節干細胞概述68第一節干細胞概述

一、干細胞（stemcell）的概念二、干細胞的特征三、干細胞的分類四、干細胞分化發育的途徑

五、細胞因子

第一節干細胞概述一、干細胞（stemcell）的概69一、干細胞概念

具有自我更新、高度增殖能力的細胞，能產生表現型和基因型和自己完全相同的子細胞，同時還能分化為祖細胞。即這些細胞可以通過細胞分裂維持細胞群的大小，同時又可以進一步分化成各種不同的組織細胞，從而構成有機體各種復雜的組織和器官。

一、干細胞概念具有自我更新、高度增殖能力的細胞，70二、干細胞的一般特性發育的全能性或多能性無限的自我更新能力長的生命周期及相對慢的增殖速度極強的再生能力易操作性

二、干細胞的一般特性發育的全能性或多能性711、發育的全能性或多能性

ES細胞具有發育全能性，適當條件下，在體外長期培養或凍存，也不影響。小鼠ES在實驗室已培養10多年。人類ES細胞在體外已傳代250代。組織干細胞以前一直以為只能分化出來源組織的細胞類型，目前的研究已發現可分化成來源以外組織的細胞。如骨髓間質干細胞，可分化為星形膠質細胞、神經細胞、少突膠質細胞、血細胞、肝細胞、肌細胞等。但多數組織干細胞是單能性的，如生精干細胞。1、發育的全能性或多能性

ES細胞具有發育全能性，適當條件下722、無限的自我更新能力

成體組織的干細胞群相對穩定，干細胞通過不對稱分裂方式在完成組織細胞更新補充的同時，也使干細胞池保持穩定。如果在干細胞水平出現DNA復制錯誤，這些變異的遺傳信息將隨著不對稱分裂而擴大到整個干細胞群，導致異常分化和細胞功能紊亂。2、無限的自我更新能力成體組織的干細胞群相對穩定，干細胞通733、長的生命周期及相對慢的

增殖速度

不同組織干細胞自我更新速度不同，如小腸和造血系統的上皮細胞更新速度較快，約12小時。但肝干細胞只在受損傷較重的情況下，才激活和分裂。神經干細胞長期存在在神經組織中，不知道它的功能是什么。在機體穩定狀態下，組織細胞數量的保持和補充主要是定向祖細胞。干細胞只是在必要時分裂補充定向祖細胞。相對祖細胞，干細胞分裂速度慢。3、長的生命周期及相對慢的

增殖速度不同組織干細胞自我更新744、極強的再生能力

多數干細胞都有參與組織再生和修復的能力。個別干細胞如神經干細胞在體外誘導實驗中具有分化潛力，但在體內，就沒有這個能力，認為缺乏干細胞分化的環境和條件，所以中樞神經系統損傷后不能修復。4、極強的再生能力多數干細胞都有參與組織再生和修復的能力。75

5、易操作性干細胞容易在體外培養，為各種遺傳操作創造了條件。如基因轉移、基因打靶等都不影響干細胞的發育潛力。如利用ES細胞做為外源基因的載體。5、易操作性干細胞容易在體外培養，為各種遺傳操作創造了條件76三、干細胞的分類

以細胞分化能力來分：1、單能干細胞2、多能干細胞3、全能干細胞以細胞來源分：1、胚胎干細胞（ES、EG）2、組織干細胞（成體干細胞）三、干細胞的分類

以細胞分化能力來分：771、單能干細胞只能向一種細胞分化或密切相關的兩類細胞分化。如皮膚上皮干細胞。這個概念以后是否能存在？1、單能干細胞只能向一種細胞分化或密切相關的兩類細胞分化。如782、多能干細胞（pluripotentstemcell）

具有分化出多種組織細胞的潛能，但不能形成完整有機體。如小腸干細胞可分化為上皮細胞、腺細胞等。骨髓造血干細胞可形成12種細胞。2、多能干細胞（pluripotentstemcell）793、全能干細胞（totipotentstemcell）能分化成各種細胞，形成一個完整的有機體潛能。如受精卵和胚胎干細胞。

3、全能干細胞（totipotentstemcell）80四、

干細胞分化發育的途徑

干細胞——定向祖細胞——分化細胞四、干細胞分化發育的途徑

干細胞——定向祖細胞——分化細81干細胞具有無限的自我更新能力，但分裂不頻繁，數量保持穩定。定向祖細胞增殖能力有限，有一定的分化潛力，是干細胞最終形成某種分化細胞的祖先細胞（progenitorcell）。分化細胞的分化標記基因全部表達，沒有繼續分裂能力，壽命較短。也有例外如神經細胞壽命長。

干細胞具有無限的自我更新能力，但分裂不頻繁，數量保持穩定。82

干細胞祖細胞分化細胞是否表達分化標記蛋白沒有開始具備有增殖能力無限有無自我更新能力無限無無產生分化后代的能力有有限無參與受損組織的再生能力長期有暫時有無

再生和干細胞課件83五、干細胞不對稱分裂

不對稱分裂：干細胞分裂產生2個細胞，1個為干細胞，另一個為祖細胞，然后由祖細胞產生分化細胞。如多數無脊椎動物。對稱分裂（群體不對稱分裂）：從單個干細胞看，干細胞分裂產生2個細胞，或者都是干細胞，或者都為祖細胞，為對稱分裂。但從干細胞群體看，平均每個干細胞仍為不對稱分裂，如哺乳動物。五、干細胞不對稱分裂不對稱分裂：干細胞分裂產生2個細胞，184六、細胞因子與干細胞微環境

細胞因子在傳遞細胞與胞外基質間、細胞與細胞間的信息中起重要作用。細胞因子有干細胞因子（SCF）、白細胞介素(ILs)、干細胞生長因子(CSF)、表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)等。六、細胞因子與干細胞微環境

細胞因子851999年Goodell分離出小鼠肌干細胞，體外培養5天后，與少量的骨髓間質細胞一起移植入小鼠中，結果肌干細胞分化為各種血細胞。這個現象稱為干細胞橫向分化，認為是周圍環境影響的結果。干細胞微環境（干細胞壁戶，Niche）對細胞分化起很重要的調控作用

1999年Goodell分離出小鼠肌干細胞，體外培養5天后，86第二節

胚胎干細胞的研究一、胚胎干細胞的概念二、胚胎干細胞的研究歷史三、胚胎干細胞的分離培養、建系技術四、定向誘導分化五、胚胎干細胞系基本特征第二節

胚胎干細胞的研究一、胚胎干細胞的概念87一、胚胎干細胞的概念從早期胚胎內細胞團（innercellmass,ICM）（大約140個細胞）分離來的（ES細胞）或從生殖嵴分離的原生殖細胞（EG細胞），經體外抑制分化培養，所獲得的具有保持未分化狀態的無限增殖能力的細胞，這些細胞在適宜的條件下，能夠分化成各種類型的細胞、組織。一、胚胎干細胞的概念從早期胚胎內細胞團（innercell88二、胚胎干細胞的研究歷史

20世紀80年代初，英國劍橋大學Evans和Kaufman以及美國Martin實驗室獨立從小鼠囊胚分離可在體外培養的正常干細胞，名為EK細胞。開創了ES細胞生物學研究的新時代。在此后胚胎干細胞在其他動物的分離和建系卻受挫折，到80年代后期才有所突破。20世紀90年代美國Matsui等從小鼠9天的胚胎生殖嵴建立了生殖細胞系，稱EG細胞系，以后其他動物也相繼建立ES和EG細胞系。1998年美國威斯康星大學的Thomson等利用36枚新鮮或凍存的人工體外受精的胚胎，獲得人的ICM細胞，建立了5株ES細胞系，以后從流產的胎兒培養出EG細胞系。這兩個細胞系的建立和應用可能涉及社會和倫理問題，應當引起重視。1981-2000年，建立豬、牛、兔、綿羊、山羊、魚、倉鼠、恒訶、河猴、人ES細胞系。二、胚胎干細胞的研究歷史

20世紀80年代初，英國89三、胚胎干細胞的培養、建系技術

1、抑制分化培養2、ES細胞的分離培養3、EG細胞的分離培養三、胚胎干細胞的培養、建系技術

1、抑制分化培養901、抑制分化培養由于早期細胞離體后極易發生分化，所以首先阻止其分化，確保全能性是關鍵。細胞分化抑制物是飼養層細胞、條件培養基和分化抑制因子，抑制分化培養方法有2種。1）飼養層細胞培養法2）無飼養層細胞培養法1、抑制分化培養由于早期細胞離體后極易發生分化，所以首先阻止91飼養層培養法分離的細胞生長在小鼠飼養層上（一種用射線照射或者加入有絲分裂抑制劑如用絲裂霉素處理的成纖維細胞層，成纖維細胞不能分裂，但能分泌LIF）。

操作比較麻煩，但成功率高，是早期培養的首選方法。飼養層培養法分離的細胞生長在小鼠飼養層上（一種用射線照射或者92無飼養層培養法在培養基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素6或條件培養基如2-3周齡幼年大鼠心肌細胞條件培養液。無飼養層培養法在培養基中加入白血病抑制因子（LIF）、白介素932、ES細胞的分離培養基本培養液：15%-20%小牛血清、0.1mmol/l旈基乙醇和雙抗的DMEM液。將囊胚接種到鋪有飼養層的培養皿中，培養2-3天分離ICM細胞。

免疫手術法常規培養法2、ES細胞的分離培養基本培養液：15%-20%小牛血清、0943、EG細胞的分離培養

在解剖鏡下取生殖嵴，接種到飼養層細胞上，細胞分裂增殖，消化后再培養。3、EG細胞的分離培養

在解剖鏡下取生殖嵴，接種到飼養層細胞95

四、定向誘導分化細胞誘導分化是細胞與其微環境相互間復雜而精密協調的分子細胞學過程。60年代已知誘導現象。譜系分化：經過譜系祖細胞、譜系定型細胞和終末分化細胞的分化全過程。會出現不穩定的過渡細胞。用于基礎研究。定向分化：控制ES細胞定向產生單一類型的終末分化細胞。用于細胞移植和治療。定向誘導的體細胞有：造血細胞、內皮細胞、神經細胞、肝細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、生殖細胞。

四、定向誘導分化細胞誘導分化是細胞與其微環境相互間復雜而精96

四、定向誘導分化誘導物有兩類：1、誘導細胞可逆性的輕度損傷。如無機物、有機酸、醇、氨水或缺鈣的鹽水等。滲透壓改變，造成神經細胞分化。2、與被誘導的細胞表面受體結合而介導的細胞分化。類固醇激素、多肽生長因子。誘導物濃度、時間、作用模式可導致不同分化，非常復雜，定向誘導是胚胎干細胞研究的熱門話題。

四、定向誘導分化誘導物有兩類：97五、胚胎干細胞系基本特性體外無限增殖體外產生分化細胞體內產生畸胎瘤巢狀生長，有多能胚胎干細胞分子標記染色體數目和核型正常遺傳可操作性形成嵌合體實現種系傳遞五、胚胎干細胞系基本特性體外無限增殖98第四節組織干細胞（成體干細胞）

一、組織干細胞概述二、表皮干細胞（ESCs）三、骨髓干細胞四、神經干細胞五、成肌細胞

六、肝干細胞七、成體干細胞研究中存在的問題3第四節組織干細胞（成體干細胞）

一、組織干細胞概述399一、組織干細胞概述1、概念2、對組織干細胞的認識一、組織干細胞概述1、概念1001、概念

一群分布在成體組織中未分化的具有自我更新潛能的并負有構建和補充某種組織的各種類型的細胞的干細胞。1、概念一群分布在成體組織中未分化的具有自我更新潛101對成體干細胞的認識傳統觀念：人體除血液、皮膚、消化管和肝有再生能力，其他組織沒有再生能力；成體干細胞是專能的，只屬于某種組織，即造血干細胞只能形成血細胞。最新研究：成體干細胞的發育潛能可跨越組織和胚層界限如小鼠神經干細胞移植到經射線照射的骨髓，分化出血液細胞。此后發現可分化為肌細胞。表明微環境的改變，造成分化潛能的改變。對成體干細胞的認識傳統觀念：人體除血液、皮膚、消化管和肝有再102二、表皮干細胞ESCsESCs的概念ESCs的生物學特征ESCs的鑒別與分離方法二、表皮干細胞ESCsESCs的概念103再生和干細胞課件104再生和干細胞課件105

ESCs的概念

存在于表皮內，一生均保持有增殖能力，可增殖分化為表皮中各種類型的細胞。從再生能力角度：表皮中有表皮干細胞、短暫增殖細胞或祖細胞(transitamplifying，TA)、有絲分裂后(post-mitoticdifferentiating，PMD)細胞。

ESCs的概念

存在于表皮內，一生均保持有增殖能力，可增殖106ESCs的生物學特征

自我更新增殖能力慢周期性對基底膜的黏附作用形態學特點定位

ESCs的生物學特征自我更新增殖能力107在體內表現為可增殖分化形成表皮的全層并維持自身的數量，在體外則表現為克隆性生長。自我更新增殖能力

在體內表現為可增殖分化形成表皮的全層并維持自身的數量，在體外108慢周期體內表現為標記滯留細胞（label-retainingcell,LRC）。在新生動物細胞分裂活躍時摻入氚標記的胸苷，細胞在DNA合成的過程中攝取標記的核苷酸而將標記整合到

DNA中，由于干細胞分裂緩慢，這樣的標記可以維持相當長的一段時間，因而可長期探測到放射性活性，如小鼠表皮干細胞的滯留標記可長達兩年。

慢周期體內表現為標記滯留細胞（label-retaining109對基底膜的黏附作用

干細胞主要通過表達整合素實現對基底膜各種成分的粘附。各種整合素作為受體分子與基底膜各種成分相應的配體結合，如與層黏連蛋白結合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1、α6β4，與纖連蛋白結合的有整合素α3β1，與膠原結合的有整合素α2β1。干細胞與基底膜粘附是干細胞維持其特性的基本條件。

對基底膜的黏附作用干細胞主要通過表達整合素實現對基底膜各種110形態學特點

超微結構均具有未分化細胞的特征；細胞體積小，細胞內細胞器稀少，RNA含量低，在組織結構中位置相對固定。形態學特點

超微結構均具有未分化細胞的特征；細胞體積小，細胞111定位定位隱蔽、安全，血供豐富，營養好。在沒有毛發的表皮組織，ESCs與祖細胞（TA細胞）在表皮基底層呈片狀分布，約占基底細胞總數的1%～10%。定位定位隱蔽、安全，血供豐富，營養好。在沒有毛發的表皮組織，112

ESCs的鑒別與分離方法

標記滯留細胞分析法克隆分析法細胞膜表面標志物–整合素

細胞內標志物-角蛋白K15、K19

ESCs的鑒別與分離方法

標記滯留細胞分析法113三、骨髓干細胞造血干細胞間質干細胞三、骨髓干細胞造血干細胞114造血干細胞

骨髓中造血干細胞是各種血細胞的前體細胞。因為細胞表面存在一些標志物，可運用流式細胞儀和磁性分選技術從骨髓中分離到足夠數量的造血干細胞。若移植到不同的體內環境中，形成各種類的細胞。外周血干細胞和臍血干細胞可取代骨髓移植。造血干細胞骨髓中造血干細胞是各種血細胞的前體細胞。因為細胞115再生和干細胞課件116間質干細胞

能分化為成肌細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞、肌細胞等，對組織修復應用前景較好。間質干細胞

能分化為成肌細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞117四、成肌細胞骨骼肌干細胞位于肌纖維周圍，稱肌衛星細胞。參與骨骼肌的修復。體外培養發現還能產