基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件抗蟲棉的培育的過程：基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件1抗蟲棉的培育的過程：抗蟲棉的培育的過程：2基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲取（2）（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建3一、目的基因的獲取1.目的基因：2.獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因一、目的基因的獲取1.目的基因：（1）從基因文庫中獲取目的基4補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游啟動(dòng)子終止子補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子外顯子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游RNA聚合酶的始結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶的末結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼5結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序6（一）從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）1.基因文庫

基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（一）從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）1.基因文庫基因7基因組文庫的構(gòu)建模式圖基因組文庫的構(gòu)建模式圖8部分基因文庫的構(gòu)建模式圖部分基因文庫的構(gòu)建模式圖9基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫10解旋酶催化1)解旋模板2)合成互補(bǔ)子鏈

以母鏈為模板進(jìn)行堿基配對(duì)(在DNA聚合酶的催化下,利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行)母鏈（舊鏈）子鏈（新鏈）子代DNA:同時(shí)進(jìn)行(邊解旋邊復(fù)制)組成3)形成新的DNA分子補(bǔ)：DNA復(fù)制過程：作用：把單個(gè)脫氧核苷酸連接成鏈(形成磷酸二酯鍵)解旋酶催化1)解旋模板2)合成互補(bǔ)子鏈112.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：2原理：DNA復(fù)制多聚12PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈D13PCR技術(shù)的操作過程PCR技術(shù)的操作過程14PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形15PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理16

過程：變性、退火、延伸三步曲變性：90～95℃退火：55～60℃延伸：70～75℃過程：變性、退火、延伸三步曲變性：90～95℃173.人工合成法利用DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？3.人工合成法利用DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核18課堂小結(jié)1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫歸納：獲取目的基因的方法課堂小結(jié)1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合19思考：為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、構(gòu)建表達(dá)載體思考：為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？二、構(gòu)建表達(dá)載體20思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎212.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因2.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)22啟動(dòng)子：終止子：標(biāo)記基因：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶23相同點(diǎn)：不同點(diǎn)：思考：載體與表達(dá)載體的異同都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。相同點(diǎn)：思考：載體與表達(dá)載體的異同都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。表24基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶切割兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶連接重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端用同一種限制酶分別切割目的基因個(gè)質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA連接酶使之連接基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶切割兩個(gè)切口DNA25三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入____261.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法27（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受28②轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色29基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將30（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過312.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)32（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到33常用法：常用菌：微生物作受體細(xì)胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用法：常用菌：微生物作受體細(xì)胞原因：過程：Ca2+處理大腸34受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵35四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝36四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個(gè)體生物學(xué)水平鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):37轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)（DNA與DNA）變性變性1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)是否插入了目的38變性方法——DNA與mRNA雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)變性方法——DNA與mRNA雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)391、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋40（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等41類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達(dá)和檢測(cè)類步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞D42歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞感受細(xì)胞法（微生物）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射法（動(dòng)物）目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯；個(gè)體歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因43課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A課堂練習(xí)1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是()A44課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細(xì)胞中提取④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D(zhuǎn)課堂練習(xí)2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()D45課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D課堂練習(xí)3、有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）D46課堂練習(xí)4、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞不需堿基互補(bǔ)配對(duì)，其余三個(gè)步驟都涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)課堂練習(xí)4、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基47課堂練習(xí)即時(shí)應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠)5．(2009年高考浙江卷)下列關(guān)于基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是(

)A．目的基因和受體細(xì)胞均可來自動(dòng)、植物或微生物B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D課堂練習(xí)即時(shí)應(yīng)用(隨學(xué)隨練，輕松奪冠)D48基因工程的基本操作程序教學(xué)課件49ThankYou世界觸手可及攜手共進(jìn)，齊創(chuàng)精品工程ThankYou世界觸手可及攜手共進(jìn)，齊創(chuàng)精品工程50基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件抗蟲棉的培育的過程：基因工程的基本操作程序教學(xué)課件基因工程的基本操作程序教學(xué)課件51抗蟲棉的培育的過程：抗蟲棉的培育的過程：52基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲取（2）（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建53一、目的基因的獲取1.目的基因：2.獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因一、目的基因的獲取1.目的基因：（1）從基因文庫中獲取目的基54補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游啟動(dòng)子終止子補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子外顯子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游RNA聚合酶的始結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶的末結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼55結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序56（一）從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）1.基因文庫

基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（一）從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）1.基因文庫基因57基因組文庫的構(gòu)建模式圖基因組文庫的構(gòu)建模式圖58部分基因文庫的構(gòu)建模式圖部分基因文庫的構(gòu)建模式圖59基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫60解旋酶催化1)解旋模板2)合成互補(bǔ)子鏈

以母鏈為模板進(jìn)行堿基配對(duì)(在DNA聚合酶的催化下,利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行)母鏈（舊鏈）子鏈（新鏈）子代DNA:同時(shí)進(jìn)行(邊解旋邊復(fù)制)組成3)形成新的DNA分子補(bǔ)：DNA復(fù)制過程：作用：把單個(gè)脫氧核苷酸連接成鏈(形成磷酸二酯鍵)解旋酶催化1)解旋模板2)合成互補(bǔ)子鏈612.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。2原理：DNA復(fù)制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1概念：2原理：DNA復(fù)制多聚62PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈D63PCR技術(shù)的操作過程PCR技術(shù)的操作過程64PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴(kuò)增PCR技術(shù)的操作過程PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形65PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理66

過程：變性、退火、延伸三步曲變性：90～95℃退火：55～60℃延伸：70～75℃過程：變性、退火、延伸三步曲變性：90～95℃673.人工合成法利用DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核苷酸序列已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？3.人工合成法利用DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核68課堂小結(jié)1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫歸納：獲取目的基因的方法課堂小結(jié)1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合69思考：為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、構(gòu)建表達(dá)載體思考：為什么要構(gòu)建基因表達(dá)載體？二、構(gòu)建表達(dá)載體70思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎712.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因2.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)72啟動(dòng)子：終止子：標(biāo)記基因：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。啟動(dòng)子：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶73相同點(diǎn)：不同點(diǎn)：思考：載體與表達(dá)載體的異同都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。相同點(diǎn)：思考：載體與表達(dá)載體的異同都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)。表74基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶切割兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶連接重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端用同一種限制酶分別切割目的基因個(gè)質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA連接酶使之連接基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶切割兩個(gè)切口DNA75三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入____761.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法77（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受78②轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色79基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將80（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過812.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)82（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到83常用法：常用菌：微生物作受體細(xì)胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用法：常用菌：微生物作受體細(xì)胞原因：過程：Ca2+處理大腸84受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵85四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝86四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個(gè)體生物學(xué)水平鑒定四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):87轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)（DNA與DNA）變性變性1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生探針15N15N14N14N（1）檢測(cè)是否插入了目的88變性方法——DNA與mRNA雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)變性方法——DNA與mRNA雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)891、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)1、檢測(cè)——分子水平的檢測(cè)提取（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋90（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等91類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種