(完整(完整word版)細菌的生理生化鑒定方法方法2.3。5細菌的生理生化鑒定1、形態學觀察采用插片法、埋片法,對該拮抗細菌的菌落形態特征作鏡檢觀察。用革蘭氏染色進行油鏡觀察。革蘭氏染色溶液和試劑：革蘭氏染液，草酸銨結晶紫染液，盧戈式碘液，95％乙醇，番紅復染液等.試驗步驟：(1)涂片：取活躍生長期菌種按常規方法涂片(不易過厚)、干燥和固定。初染：滴加草酸銨結晶紫染液覆蓋涂菌部位1?2min,用水沖洗至流出水無色。媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋Imin,傾去碘液，水洗至流出水無色。脫色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液(一般20~30s)，當脫色至流出液無色時立即用水洗去乙醇。復染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復染液染色2min,水洗，用吸水紙吸去殘水晾干。鏡檢：用油鏡觀察。芽孢染色制片:按常規方法涂片、干燥及固定。加熱染色：向載玻片滴加數滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱至染液冒蒸汽并維持5min,加熱時應注意補充染液，切勿讓涂片干涸.脫色：待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色.復染：用0.5%番紅水溶液復染2min。水洗:用緩流自來水沖洗至無色。鏡檢：晾干載玻片后油鏡鏡檢。鞭毛染色（硝酸銀染色法）（1）載玻片準備:將載玻片置于含洗衣粉或洗滌劑的水中煮沸20min,然后用清水充分洗凈,再置于95%乙醇中浸泡，使用時取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。（2）菌液制備：用接種環挑取菌落邊緣菌體，懸浮于1?2mL無菌水中制成菌懸液，不能劇烈震蕩。（3）制片:取一滴菌懸液滴到載玻片一側，傾斜玻片,使菌懸液流向另一邊,用吸水紙吸取多余的菌懸液,自然干燥。（4）染色：滴加硝酸銀染色A液覆蓋3?5min，用蒸餾水充分洗去A液，再滴加B液染色約1min,期間可用微火加熱，當涂面出現明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗。自然干燥后用油鏡觀察。菌體呈深褐色,鞭毛顯褐色。（5）鏡檢：用油鏡鏡檢觀察。A、B液需現用現配（4h內效果最佳，1d內可用）：A：單寧酸5g,三氯化鐵1.5g，蒸餾水100mL，加1%氫氧化鈉1mL，15%甲醛2mL.B：硝酸銀粉末2g,水100mL，溶解勻均，取出10mL回滴用，往90mL溶液中加濃氨水到出現大量沉淀時再加濃氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出現薄霧。2、糖類分解試驗配方：蛋白胨1。0g;NaCI0。5g;0。2%溴百里香酚蘭1。2mL;葡萄糖1.0g;蒸餾水100mL。基本原理：糖類分解實驗是常用的鑒別微生物的生化反應，鑒定細菌能否利用分解某種糖產生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氨氣、甲烷、二氧化碳等）。當發酵產酸是，指示劑可有紫色（pH6。8）轉變為黃色（pH5。2）.氣體的產生可由倒置的小管中有無氣泡來證明。試驗步驟:用記號筆在試管外面分別標明發酵培養基名稱和所接種的細菌的編號。取盛有葡萄糖發酵培養基的試管，按編號接種細菌，每種細菌做兩個平行,可留一個空白，作為對照。在接種后要輕搖試管，防止倒置的小試管進入氣泡.再將將上述已接種的和對照管置37°C溫室中培養2?3d。觀察顏色變化及小試管中有無氣泡。3、V—P試驗配方：蛋白胨1.5g;葡萄糖1。5g;KHP01。5g;蒸餾水300mL；pH：7。424基本原理：此實驗也是常用的檢驗細菌的生化反應之一。某些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸再縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環境再被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基生成紅色化合物，稱V—P反應。試驗步驟：將被檢菌接種于試驗培養基中，培養2?7d后，于培養物中加入1mL10%的

NaOH，混勻，再加入3?4滴2%氯化鐵溶液.數小時后，培養基表面的下層出現紅色者，為陽性.4、甲基紅試驗配方：與V-P試驗的配方相同基本原理：某些細菌在糖代謝過程中，會分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸還可進一步分解，產生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養基pH將至4。5以下，當加入甲基紅試劑則呈紅色，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產酸量小，或者產生的酸進一步轉化為其它物質（如醇、酮、醚、氣體和水等），則培養基的酸度仍會在pH6。2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。試驗步驟:接種細菌于培養基，在37°C培養2~7d后，于培養物中加入幾滴甲基紅酒精溶液（0。1g甲基經溶于300mL95%乙醇中，加蒸餾水至500mL）,如呈紅色，表示陽性.5、檸檬酸鹽利用試驗配方：檸檬酸鈉1g;硫酸鎂0.2g；NaCI5g;NHHPO1g;KHPO1g;瓊脂20g；1%溴42424麝香草酚藍酒精溶液10mL;蒸餾水1000mL。基本原理：檸檬酸鹽試驗是用來檢測檸檬酸鹽能否被利用。細菌在分解檸檬酸鹽及培養基中的磷酸銨后，產生堿性化合物，是培養基的pH升高，當加入1%溴麝香草酚藍指示劑時，培養基就會有綠色轉變為深藍色。溴麝香草酚藍的指示范圍為：pH小于6。0時呈黃色，pH在6。5?7.0時為綠色，pH大于7.6時呈藍色。試驗步驟：將被檢菌接種到Simmons固體檸檬酸鹽培養基上，37°C下培養2?4d，能利用檸檬酸（完整word版）細菌的生理生化鑒定方法鹽的細菌表現為有細菌生長,培養基變為藍色，不能利用檸檬酸鹽的細菌不生長，培養基不變色。6、硝酸鹽還原試驗配方：硝酸鉀0。2g；蛋白胨5g;蒸餾水1000mL；pH：7。4。甲液：4-苯胺磺酸（對氨基苯磺酸）0.4g；5mol/L冰醋酸50mL。乙液：a—萘胺0。25g;5mol/L冰醋酸50mL.基本原理：某些細菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的4-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與a-萘胺結合生成N—a萘胺偶苯磺酸。試驗步驟:將被檢細菌接種于硝酸鹽培養基中，37°C培養1~2d,每管中先加入甲試劑0.1mL,再加乙試劑數滴，如出現紅色，表示陽性。注：本試驗陰性的原因有三：細菌不能還原硝酸鹽；亞硝酸鹽繼續分解，生成氨和氮；培養基不適于細菌的生長。如欲檢查培養基中硝酸鹽是否未被分解，可再加入鋅粉少許，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽而呈現紅色。7、淀粉水解試驗配方：牛肉膏0°5g;蛋白胨1g;氯化鈉0°5g;可溶性淀粉0°2g；蒸餾水100mL；瓊脂2g；pH：7.0?7.2。基本原理：有些細菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍色?試驗步驟：將細菌劃線接種于平板上，37C左右培養1?2d,生長后取出，在菌落處滴加革蘭氏碘液少許，能水許解淀粉的細菌菌落周圍有透明環，培養基會呈深藍色。8、吲哚（靛基質）試驗配方：蛋白胨1g；NaCI0.5g;蒸餾水1000mL；pH：7.6。吲哚試劑自行配制：對二甲基氨基苯甲醛0。5g；乙醇（95%）47。5mL;濃鹽酸10mL.基本原理：有些細菌可以產生色氨酸酶，分解色氨酸，產生吲哚和丙酮酸。吲哚與二甲基氨基苯甲醛反應生成紅色的玫瑰吲哚，因此可根據細菌能否分解色氨酸產生吲哚來鑒定菌種.（完整word版）細菌的生理生化鑒定方法試驗步驟:將待檢菌種接種于鄧享氏蛋白質的胨溶液中，37°C培養1?2d.于培養液中加入戊醇或二甲苯2?3mL,搖勻，靜置片刻后，沿管壁加入吲哚試劑2ml,如出現紅色沉淀，表示為陽性。9、接觸酶試驗配方:牛肉膏蛋白胨培養基基本原理：具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫生成水和新生態氧，繼而形成分子氧出現氣泡。試驗步驟：將1ml3%的HO傾注于生長物（菌落或菌苔）上，有氣泡（0）發生者為陽222性。也可于清潔小試管中加少量（30%），再用清潔無菌的細玻棒（或火焰封口的毛細管或鎳鉻做成的接種環）醮細菌少許，插入H0液面下，有氣泡者為陽性.也可在玻片上滴一滴H02222蘸取少許培養物，混合，有氣泡者為陽性.2.3.6確定菌種類型參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》（Buchanan＆Gibbons，1984）和《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，1999）確定菌種類型。結果3.3菌株的生理生化鑒定3.3。1菌落的特征分析通過顯微鏡觀察菌落形態特征，結果見表3。表3拮抗細菌K1、K2與K3的菌落特征菌株K1K2K3形狀橢圓狀圓形桿狀革蘭氏染色陰性陰性陰性芽孢無無無菌落形態橢圓形圓形梅花形菌落顏色乳白淺黃棕黃菌落隆起度凸起凸起凸起（完整（完整word版）細菌的生理生化鑒定方法菌落邊緣形狀光滑光滑粗糙菌落表面狀態光滑光滑光滑菌落光澤有光澤有光澤無光澤菌落干濕程度干燥濕潤干燥菌落透明程度不透明不透明不透明3。3.2菌株的生理生化鑒定糖類分解試驗K11K22K3111V-P試驗KMK2?K3|甲基紅試驗淀粉水解試驗K1糖類分解試驗K11K22K3111V-P試驗KMK2?K3|甲基紅試驗淀粉水解試驗K1『K2.K3?吲哚（靛基質）試驗檸檬酸鹽利用試驗接觸酶試驗圖3拮抗細菌K1、K2與K3的生理生化特征表4細菌的生理生化鑒定結果

菌種K1K2K3糖類分解試驗+－+V