1、第十章高效液相色譜法第一節 固定相和流動相第二節 高效液相色譜儀第三節 液-固色譜法第四節 化學鍵合相色譜法第五節 離子交換色譜法第六節 尺寸排阻色譜法第七節 分離方式的選擇及應用 high performance liquid chromatograph,HPLC2022/9/181色譜法分類示意圖2022/9/182概述 高效液相色譜法是在氣相色譜和經典液相色譜的基礎上70年代初期發展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。 現代液相色譜和經典液相色譜沒有本質的區別。不同點僅僅是現代液相色譜比經典液相色譜有較高的效率 和實現了自動化 操作。經典的液相色譜法，流動相在常壓下輸送，所用的固定相柱

2、效低，分析周期長。而現代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現代液相色譜法。2022/9/183一、HPLC與經典LC區別主要區別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1經典LC：僅做為一種分離手段 柱內徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低（H，n） 分析周期長 無法在線檢

3、測2HPLC：分離和分析 柱內徑26mm，固定相粒徑17% 分配色譜 硅膠失活載體 吸附的水固定液2022/9/1846第四節 化學鍵合相色譜法一、概述二、化學鍵合相三、反相鍵合相色譜法四、正相鍵合相色譜法2022/9/1847一、概述 將固定液機械地涂漬在擔體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解。以及流動相經過色譜柱的機械沖擊，固定相會不斷流失，即使將流動相預先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個前置柱，使流動相先通過前置柱，再進入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。 2022/9/1848續前 70年代初發展了一種新型的固定相化學鍵合固定相

4、。這種固定相是通過化學反應把各種不同的有機基團鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學鍵合色譜適用于分離幾乎所有類型的化合物。2022/9/1849 根據鍵合相與流動相之間相對極性的強弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現代液相色譜中應用最為廣泛。2022/9/1850二、化學鍵合相 化學

5、鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應之前，要對硅膠進行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機物或有機硅化合物起反應，制備化學鍵合固定相。2022/9/1851鍵合相可分為四種鍵型：A 硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相 將醇與硅膠表面的羥基進行酯化反應，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。B 硅氮型（=Si-N=）鍵合相 如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉化成鹵素（氯化），再與各種有機胺反應，可以得到各種不同極性基因的鍵合相。可用非極性或強極性的溶劑作為流動相。202

6、2/9/1852C 硅碳型（=Si-C=）鍵合相 將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機基團直接鍵合在硅膠表面上。D 硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相 將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反應制備。這類鍵合相具有相當的耐熱性和化學穩定性，是目前應用最為廣泛的鍵合相。2022/9/1853三、反相鍵合相色譜法 在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱O D S或C18）硅膠-苯基等，用強極性的溶劑為流動相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機鹽的緩沖液等。 目前，對于反相色譜的保留機制還沒有一致的看法，大致有兩種觀點：一種認為屬于分配色譜，另

7、一種認為屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。 分配色譜的作用機制是假設混合溶劑（水+有機溶劑）中極性弱的有機溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進行分配。2022/9/1854 吸附色譜的作用機制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強的疏水特性。當用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分離有機化合物時，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產生締合作用。另一方面，被分離物的極

8、性部分受到極性流動相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。 一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數越大，則締合作用越強，分配比也越大，保留值越大。 2022/9/1855四、正相鍵合色譜法 在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以

9、調節流動相的洗脫強度。通常用于分離極性化合物。2022/9/1856 一般認為正相色譜的分離機制屬于分配色譜。組分的分配比k值，隨其極性的增加而增大，但隨流動相中極性調節劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。 該法主要用于分離異構體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。2022/9/1857化學鍵合色譜具有下列優點： A. 適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學鍵合反應，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。 B. 由于

10、鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復雜體系的分離創造了條件。2022/9/1858續前C. 鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學穩定性和熱穩定性。D. 固定相柱效高，使用壽命長，分析重現性好。2022/9/18591分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法） 缺點：系統內部壓力大，易流失，不實用 固定液極性NLLC 固定液非極性RLLC3正相色譜固定液極性 流動相極性（NLLC） 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分離極性組分 反相色譜固定液極性 固定相極性 底劑

11、+ 有機調節劑（極性調節劑） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF2022/9/18624流動相極性與k的關系： 流動相極性，洗脫能力，k，組分tR5出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱6適用：非極性中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜1分離機制：溶質分子與固定相之間定向作用力、 誘導力、或氫鍵作用力2固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3流動相：極性小（同LSC） 底劑 + 有機極性調節劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2022/9/18634流動相極性與k的關系： 流動相極性，洗脫能力，組分tR，k5出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先 出柱極性大的組分后出柱

12、6適用： 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小） 分離物質也相似 氨基鍵合相與硅膠性質差別大，堿性 分析極性大物質、糖類等2022/9/1864第五節 離子交換色譜法一、原理二、固定相三、流動相四、離子色譜法ion-exchange chromatograph2022/9/1865 離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進行分離。它不僅適用無機離子混合物的分離，亦可用于有機物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此應用范圍較廣。 2022/9/1866一、原理 離子交換色

13、譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質電離后產生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進行可逆交換，其交換反應通式如下： 陽離子交換： 陰離子交換： 一般形式： R一AB RBA2022/9/1867對于陽離子交換樹脂，一價離子的選擇性順序為： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價離子的順序為： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對于陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3

14、-H2P04-IO3-CH3COOF2022/9/1868二、固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據官能基的離解度大小還有強弱之分（見下表）表10- 2 離子交換劑上的官能基2022/9/1869 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： 1. 多孔型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分2. 薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約為30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層。3. 表面多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂

15、一層很薄的離子交換樹脂。2022/9/18704. 離子交換鍵合固定相 它是用化學反應將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優良的離子交換固定相，它的優點是機械性能穩定，可使用小粒度固定相和高柱壓來實現快速分離。 2022/9/1871三、流動相 離子交換色譜法所用流動相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強度）的緩沖溶液。通過改變流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競爭吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。 關于pH值的影響，要

16、視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留值增大。 2022/9/1872四、離子色譜法 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。 離子交換色譜法在無機離子的分析和應用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質流動相的高背景電導信號淹沒而無法檢測。為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術：2022/9/

17、1873續前 他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經陽離子交換劑的分離柱后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發生兩個重要反應：2022/9/1874 R+OHH+Cl- R+Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反應可見：經抑制柱后，一方面將大量酸轉變為電導很小的水，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽

18、離子M+轉變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。 2022/9/1875續前 在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，Frits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如110-4510-4molL-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2022/9/18761.離子色譜法原理 離子色譜原理，與傳統離子交換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子

19、交換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導）；可采用電導檢測器，快速分離分析微量無機離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現，發展迅速。2022/9/18772.離子色譜具有以下優點（1）分析速度快 可在數分鐘內完成一個試樣的分析；（2）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱2022/9/18783. 離子色譜法裝置：2022/9/1879第六節 尺寸排阻色譜

20、法一、原理二、固定相三、流動相size- exclusion chromatograph2022/9/1880 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現分離的。 2022/9/1881尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點： （1）保留時間是分子尺寸的函數，有可能提供分子結構的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別

21、必須大于10才能得以分離。2022/9/1882一、原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。其固定相為化學惰性多孔物質凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其滲透過程模型見圖20-7。 2022/9/18832022/9/1884 二、固定相 排阻色譜固定相種類很多，一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經過

22、交聯而具有立體網狀結構的多聚體。 1. 軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 2022/9/18852. 半剛性凝膠 如高交聯度的聚苯乙烯（Styragel）比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。3. 剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等；它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。一般控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否則將影響凝膠孔徑，造成不良分

23、離。2022/9/1886三、流動相 排阻色譜所選用的流動相必須能溶解樣品，并必須與凝膠本身非常相似，這樣才能潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必須能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子擴散作用而影響分離效果。這對于具有低擴散系數的大分子物質分離，尤需注意。選擇溶劑還必須與檢測器相匹配。常用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品， 以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。2022/9/1887第七節 分離方式的選擇及應用 choice of separation types and applacations of HPLC 一、相對分子質量二、溶解度三、化學結構四、應用2022/9/1888色譜分離類型的選擇 要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。 選擇色譜分離方法的主要根據 是樣品的相對分