1、fish技術及其臨床應用fish技術及其臨床應用第1頁一、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH)60年代 Pardue Gall 建立（一）方法與原理：制備DNA探針（用生物素或熒光素標識）（下列圖）變性制備CS或間期細胞標本變性處理探針與待測DNA雜交洗脫用熒光素標識生物素親和蛋白使雜交區發熒光（信號放大）(下列圖） 熒光顯微鏡檢測2fish技術及其臨床應用第2頁（二）探針制備方法1.缺口平移法(Nick translatrion)用生物素（biotin)標識dUTPDNA酶切口DNApolymerase 53外切酶活性DNApolym

2、erase 53聚合酶活性3BdUTPfish技術及其臨床應用第3頁45335DNAse5335OHpDNA聚合酶標識核苷酸GGCOHOHOHOHpBBGCUAUA53355 33 5fish技術及其臨床應用第4頁分子雜交與信號放大5BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.隨機引物法（random primer):6聚核苷酸 klenow酶fish技術及其臨床應用第5頁6fish技術及其臨床應用第6頁FISH ProcedureDenature the chromosomesDenature the probeHybridizationFluorescen

3、ce stainingExamine slides or store in the dark7fish技術及其臨床應用第7頁（三）探針種類1）探針池探針（cs涂抹探針）：可結合在整條CS上每一部位。24色（常CS22條XY）8fish技術及其臨床應用第8頁9Whole chromosome probesfish技術及其臨床應用第9頁10Whole chromosome probes fish技術及其臨床應用第10頁11fish技術及其臨床應用第11頁2）著絲粒探針：結合于著絲粒處，檢測間期核內DNA數（CS數）12fish技術及其臨床應用第12頁13fish技術及其臨床應用第13頁14Repe

4、titive sequence probesfish技術及其臨床應用第14頁3）端粒探針：結合于端粒處15fish技術及其臨床應用第15頁164) 特異位置探針 :cs某一詳細位置探針 例：Yq12 repetitive probefish技術及其臨床應用第16頁17fish技術及其臨床應用第17頁18位點特異性探針fish技術及其臨床應用第18頁5）染色體臂涂抹探針：結合于csq或p上。19fish技術及其臨床應用第19頁（四）探針標識方法間接標識（前述） 時間長 信號顯著直接標識 時間短 信號弱20fish技術及其臨床應用第20頁二、FISH種類： 以FISH過程中探針結合部位或探針顏色不

5、一樣，將FISH分為各種。21fish技術及其臨床應用第21頁221.Centromere Single Color FISHfish技術及其臨床應用第22頁232.Single Color FISH (Telomeres)fish技術及其臨床應用第23頁243.Dual color FISHfish技術及其臨床應用第24頁254 多色熒光原位雜交fish技術及其臨床應用第25頁265.Spectral Karyotyping (SKY)（光譜核型分析）fish技術及其臨床應用第26頁276. 24 colors FISHfish技術及其臨床應用第27頁287.M-FISH with telo

6、meres and centromeresfish技術及其臨床應用第28頁29M-FISH with chromosome banding specific probesfish技術及其臨床應用第29頁308.間期FISHfish技術及其臨床應用第30頁三、 FISH優點（ Advantage）: less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods31fish技術及其臨床應用第31頁FISH

7、 - a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent moleculesidentify the presence and location of a region of DNA within morphologically preserved chromosome preparations, then can identifies chromosomal abnormalitiesoften used during M phase but is now used on

8、 interphase as well32fish技術及其臨床應用第32頁四、FISH在醫學中應用舉例1、用已知探針檢測未知CS畸變33fish技術及其臨床應用第33頁2、用顯微切割方法檢測未知CS畸變 顯微切割PCR CS特異探針池(黃色熒光) 與正常人CS雜交(例:2號染色體某段發黃色熒光) 結果？34fish技術及其臨床應用第34頁3、產前診療 例:檢測間期細胞內DNA分子數 例：21三體例：18三體35fish技術及其臨床應用第35頁4、植入前診療36Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD)fish技術及其臨床應用第36頁37圖示1例13/14羅式

9、易位攜帶者胚胎植入前FISH診療資料：一對6年不育，女，32歲，cs正常，男34歲，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采取單精子卵泡漿（intracytoplasmicsperm injection,ICSI)輔助授精，胚胎發育到3天6-8細胞期取出一個細胞進行雙色FISH檢測。參圖：用13q和14q探針，見核中2個13號（綠色）和2個14號（紅色）信號細胞，表明？fish技術及其臨床應用第37頁38移植后18周做羊水細胞CS檢驗fish技術及其臨床應用第38頁39PGDfish技術及其臨床應用第39頁5、腫瘤診療 腫瘤診療探針檢測間期細胞內DNA分子數腫瘤細

10、胞內有癌基因擴增40fish技術及其臨床應用第40頁41腫瘤診療fish技術及其臨床應用第41頁42慢性粒細胞白血病fish技術及其臨床應用第42頁43慢性粒細胞白血病fish技術及其臨床應用第43頁44慢性粒細胞白血病fish技術及其臨床應用第44頁456.微小染色體畸變檢測fish技術及其臨床應用第45頁46Microdeletion fish技術及其臨床應用第46頁7.遺傳病診療 （圖）例1：家系1 FISH結果用Xcs著絲粒探針（綠色）和DMD exon46探針(紅色）雜交。圖示DMD男患者FISH結果：只有Xcs著絲粒綠色信號，無DMD exon46紅色信號，說明？47fish技術及

11、其臨床應用第47頁7.遺傳病診療 （圖）48 圖示：DMD男患者姐姐2條Xcs都有DMD Exon46信號(紅色）。表明？fish技術及其臨床應用第48頁7.遺傳病診療 （圖）49圖示：DMD男患者妹妹只有1條Xcs上有DMD Exon46信號。表明？fish技術及其臨床應用第49頁7.遺傳病診療 （圖）50例2：家系2FISH結果在DMD患者母親1/3淋巴細胞中僅有1條Xcs上有DMD Exon46雜交信號，另一條上無。fish技術及其臨床應用第50頁7.遺傳病診療 （圖）51圖示：在DMD患者母親2/3淋巴細胞中在2條Xcs上有DMDExon46雜交信號。A和B結果表明？fish技術及其臨床應用第51頁7.遺傳病診療 （圖）52例3：圖示1復雜易位患者FISH結果（該患者致妻流產3次）核型：46，XY，t（5；20；16）(q35;p13;q21)三色FISH（5q綠色;16q橙色；20p藍色）結果參圖：a:5號;b:衍生5號;c:16號;d:衍生16號;e：20號;f：衍生20號.fish技術及其臨床應用第52頁53例4 FISH技術從母血中檢測胎兒有核紅細胞圖示：孕早期母血中胎兒有核紅細胞，可見YCS特異雜交信號。fish技術及其臨床應用第53頁54例5 13q