1、瘧原蟲血片制作質(zhì)量控制及瘧原蟲計(jì)數(shù)云南省寄生蟲病防治所趙曉濤趙曉濤瘧疾防制科科長云南省消除瘧疾暨全球基金瘧疾項(xiàng)目副主管 電子郵箱：zxt_ zxt423辦公室：08792141182手機(jī)Q：35566625血片制作血膜的制作用于檢查瘧原蟲的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜狀，稱薄血膜；一種是血液涂成圓盤狀，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。發(fā)熱病人血片標(biāo)本片 血膜的制作（取血時(shí)間）取血時(shí)機(jī) 現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)取血，瘧疾普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。 間日瘧在寒熱發(fā)作時(shí)，外周血液中主要可見環(huán)狀體期；發(fā)作后

2、數(shù)小時(shí)，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷的有利時(shí)機(jī)；3648小時(shí)，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20小時(shí)內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到原蟲。 血膜的制作（取血操作）取血方法 采血部位一般人為耳垂，指頭，通常在耳垂取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位（冬季用手捻動(dòng)耳垂使其充血后再行消毒），待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方，右手持消毒采血針（一人一針，避免血傳疾病）迅速刺入耳垂下端12毫米，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕向上擠壓出血。 取血量及涂片法（涂片操作）薄血膜 取潔凈的載玻片2張，1張以左手拇指，食指夾持載

3、玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分取約1微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，并形成2530度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米長度時(shí)，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長）。將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片適當(dāng)寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動(dòng)。（涂片操作） 厚血膜 用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)24圈，涂成直徑0.81厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過厚易于脫落，過薄達(dá)不到檢出率的要求。

4、血涂片質(zhì)量評價(jià)： 均勻、厚薄、頭體尾、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚 血滴小，速度慢、角度小-血膜薄血膜的制作（涂片操作）涂制厚、薄血膜的位置 通常是將厚、薄血膜涂在一張載片上。方法是將載片分為6等分，第1、2格備貼標(biāo)簽及編號(hào)用；厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部。作為標(biāo)本的血片每張玻片涂厚、薄血膜各1個(gè)；門診和發(fā)熱病人血片每片1人，涂 涂2個(gè)厚血膜1個(gè)薄血膜，以 防血膜脫落而影響檢查； 瘧疾調(diào)查時(shí)，每張玻片 可涂制23人血膜。標(biāo)本片發(fā)熱病人血片標(biāo)簽標(biāo)簽血膜的制作血膜編號(hào) 血膜制成后，立即用特種蠟筆或水筆于玻片面上寫上受檢者的號(hào)碼，以防差錯(cuò)，待薄血膜干后再用鉛筆于

5、薄血膜中寫上血片種類的代號(hào)和受檢者的個(gè)人編號(hào)，依次順序插入標(biāo)本盒內(nèi)。 制作血膜的注意事項(xiàng) 1. 玻片清洗時(shí)，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無油漬或污垢。制片時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。制作血膜的注意事項(xiàng) 2. 剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)，厚血膜未干前勿使標(biāo)本盒傾斜，以免血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不易溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時(shí)應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲吮吸血膜，干后應(yīng)及時(shí)裝入標(biāo)本盒并蓋嚴(yán)，新的木制標(biāo)本盒需敞開放置一段時(shí)間，讓木醇揮發(fā)后

6、才能使用，以免厚血膜紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。制作血膜的注意事項(xiàng) 3. 血膜讓其自然干燥，切忌用太陽曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能2448小時(shí)內(nèi)固定染色；冬天也不能超過72小時(shí)。放置時(shí)間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。若不能及時(shí)染色，薄血膜宜先用甲醇固定（13分鐘）然后用過濾清水對厚血膜溶血，晾干固定后裝入盒內(nèi)蓋嚴(yán)，待以后染色。鏡檢瘧原蟲血片的染色一、染液的種類及染色原理染液種類： 對鏡檢瘧原蟲染色雖然種類名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的多色性染液變化過來的。 多色性染液可分為水溶液和醇溶液兩類。水溶液類有羅氏（Romanowsky）染液、費(fèi)氏(

7、Field)染液等；醇溶液有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。 鏡檢瘧原蟲血片的染色（一）染液的種類醇溶液類: 有吉氏（Giemsa）染液、瑞氏（Wright）染液等。是在水溶液染液的基礎(chǔ)上改進(jìn)發(fā)展而成。目前我們推薦的是運(yùn)用醇溶液類中的吉氏（Giemsa）染液鏡檢瘧原蟲血片的染色（二）染色的原理 染色原理是染料于被染物的陰陽離子互相吸附而結(jié)合的一種化學(xué)反應(yīng)。 各種細(xì)胞和瘧原蟲主要是由不同的蛋白質(zhì)或類氨基酸組成。不同的氨基酸均含有氨基（NH2）和羧基（COOH）。在游離狀態(tài)時(shí)，氨基（NH2）獲得一個(gè)氫離子成為帶陽電的離子（NH3 + ）；而羧基失掉一個(gè)氫離子成為帶陰電的離子（

8、COO ）。鏡檢瘧原蟲血片的染色（二）染色的原理主要染料都含有美藍(lán)、伊紅和美藍(lán)氧化后的天青。美藍(lán)的有色基團(tuán)帶陽離子，是一種堿性染料，用的是鹽酸美藍(lán)。溶于水后離解為帶陰電的氯離子和能著色的美藍(lán)陽離子，故可于蛋白質(zhì)中的羧基陰離子（COO）相結(jié)合。伊紅的有色基團(tuán)帶陰離子，是一種酸性染料，染色用的是伊紅鈉鹽。溶于水中時(shí)離解為帶陽電的鈉離子和帶陰電的伊紅離子故可于蛋白質(zhì)中的氨基陽離子（NH3+）相結(jié)合。天青為美藍(lán)氧化而成。雖為堿性染劑，在染色中起染媒作用。在天青與伊紅的合并染色中瘧原蟲的核染成紅色。鏡檢瘧原蟲血片的染色（二）染色的原理染色化學(xué)反應(yīng)反應(yīng)的示意圖：瘧原蟲細(xì)胞漿的陰離子（COO） 美藍(lán)陽離子呈

9、藍(lán)色 天青（染媒作用）瘧原蟲核的陽離子（NH3+） 呈紅色 伊紅陰離子鏡檢瘧原蟲血片的染色（二）染色的原理 蛋白質(zhì)本身是陰陽電荷是相等，帶有兩基性的。所以其所帶陰陽電荷的數(shù)量可受周圍液體的酸堿度（PH）而改變，在偏酸的溶液中帶陽離子增加，易于伊紅結(jié)合，著色偏紅。在偏堿的溶液中帶陰離子增加，易于美藍(lán)結(jié)合，著色偏藍(lán)。這就說明了為何配制染液的酸堿度直接影響了血片染色的質(zhì)量，偏酸著色過紅，偏堿著色過藍(lán)。所以在染血片時(shí)稀釋液要控制在PH7.2，最為適宜，瘧原蟲的結(jié)構(gòu)才能清晰可見。 這是目前最常用的瘧原蟲染色劑，它具有方便、染色效果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，也是我們推薦的染色方法。 將吉氏粉5g置于研缽中，加入少量甘油

10、充分研磨，然后邊加邊磨，至甘油250ml加完為止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研缽中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶內(nèi)，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇250ml洗清研缽中甘油為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，置室溫內(nèi)，每天用力搖動(dòng)溶液5分鐘，3天后即可使用。 也可在帶有緊口瓶塞的硬質(zhì)玻璃瓶中放入約50個(gè)玻璃珠（直徑3 5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇緩慢地把所有染料粉沖入瓶內(nèi)，塞緊瓶塞，置于室溫內(nèi)，每天用力搖動(dòng)5分鐘，3天后即可使用。鏡檢瘧原蟲血片的染色（三）染液的配制和染色方法1、吉氏染液的配制：吉氏染液染色方法： 先用甲醇或無水酒精固定薄血膜，待干后進(jìn)行染色

11、。亦可在固定薄血膜后用清水對厚血膜溶脫血紅蛋白，然后才進(jìn)行染色。 成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升原液加中性蒸餾水98毫升稀釋均勻即成），同時(shí)對厚薄血膜染色30分鐘，然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝下）插于晾干板上，待干鏡檢。 單張血片染色：薄血膜經(jīng)固定干燥后，用2吉氏染液稀釋液12毫升，滴入血片標(biāo)本上染色30分鐘左右，或用中性蒸餾水1毫升，加吉氏母液12滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本上，染色1015分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。2、瑞式染液的配制： 將瑞氏染劑粉1g置于研缽內(nèi)，加入15ml

12、甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用500ml甲醇洗出研缽中的甘油溶液，倒入瓶中，搖勻后，置室溫下，每天搖動(dòng)5分鐘，3天后即可使用。 此方法染色的時(shí)間短，但染色效果不如吉氏染液效果穩(wěn)定，又不能大量血片染色，常用于門診應(yīng)急血片染色。 瑞氏染液的染色方法： 先用蠟筆在厚、薄血膜間劃一界限，滴幾滴蒸餾水在厚血膜上溶血。溶血后傾去水滴。在薄血膜上加瑞氏染液58滴，染色12分鐘。然后再加58滴蒸餾水于薄血膜上，用吸管將染液與蒸餾水混合均勻后，把染液引到厚血膜上，使厚血膜再染色10分鐘。用清水輕輕沖去染液，晾干。影響染色效果的因素血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個(gè)因

13、素的影響：（1）染料溶劑的質(zhì)量 染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時(shí)所用的器具必須干凈而無水份。影響染色效果的因素（2）染液的新舊 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常有沉渣。染液存放時(shí)間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制12周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。影響染色效果的因素（3）染液稀釋后使用時(shí)間 染液的主要成份是美藍(lán)、伊紅和由美藍(lán)氧化產(chǎn)生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍(lán)和天青即產(chǎn)生沉淀。因此，必須在稀釋染液當(dāng)時(shí)使用，一般在半小時(shí)內(nèi)染色力最強(qiáng)。影響染色效果

14、的因素（4）染液的稀釋濃度 染液的濃度高其著色就快而深，染色時(shí)間相對縮短，瘧原蟲寄生紅細(xì)胞的薛氏點(diǎn)粗大顯著，但顏色常偏藍(lán)；染液濃度過低則染色時(shí)間相對長一些，顏色偏酸紅，薛氏點(diǎn)不明顯或消失。影響染色效果的因素（5）染色時(shí)間 染色時(shí)間長染色效果好，反之較差。室溫高則著色快，染色時(shí)間可略縮短，氣溫低可適當(dāng)延長。因此染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染液的質(zhì)量、新舊、稀釋濃度和氣溫而適當(dāng)增減。影響染色效果的因素（6）染色用水 染液的稀釋用水和染色后沖洗用水應(yīng)選擇Ph7.07.2清潔水，通常使用的新鮮的蒸餾水或過濾的冷開水，以及自來水、井水、河水、泉水和雨水等。如果偏酸或偏堿，可用緩沖蒸餾水調(diào)整。染色后發(fā)現(xiàn)血膜顏色偏藍(lán)（偏

15、堿）或偏紅（偏酸）時(shí)，可用與之相反的酸、堿度水沖洗血片予以糾正。影響染色效果的因素(7)染色后不要直接將染液倒掉，應(yīng)沿玻片或染色缸邊緣加水使染液表面一層溢出，并輕輕沖洗，以免染液色素顆粒沾污血膜。（三） 厚薄血膜的優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍薄血膜 用血量約為2l，涂制成2cm寬4cm長面積的薄血膜。由于在制備過程中，血片通常經(jīng)甲醇固定，使紅細(xì)胞及其內(nèi)瘧原蟲的形態(tài)保持完整，便于瘧原蟲蟲種的鑒定。唯由于用血量少，為保證檢測的敏感性，常耗時(shí)較多，不適用于大規(guī)模調(diào)查。特別在醫(yī)院的化驗(yàn)室，由于要求在短時(shí)間內(nèi)作出診斷，因而極有可能出現(xiàn)漏診。 厚血膜 用血量約為4l5l。涂制成直徑1cm的厚血膜由于在制備過程中紅細(xì)

16、胞已溶解，瘧原蟲在形態(tài)上仍可分辨，但胞漿和胞核不可避免地形成一定程度的固縮。受影響較大的有大滋養(yǎng)體、裂殖體的形態(tài)。 由于厚血膜與薄血膜相比血量大，須查范圍小，節(jié)省時(shí)間，陽性檢出率較高。厚血膜能查出瘧原蟲數(shù)是薄血膜的1525倍。所以，我們推薦瘧疾診斷應(yīng)以檢查厚血膜為主。在普查時(shí)均應(yīng)查完整個(gè)厚血膜，未查見瘧原蟲則判為陰性。瘧原蟲密度計(jì)數(shù)方法一、粗略的（半定量）計(jì)數(shù)： 用厚血膜每個(gè)視野中所觀察到的瘧原蟲的平均數(shù)可粗略地估計(jì)為瘧原蟲密度。 這種方法簡便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)受制作的血膜厚度所影響，在流行病學(xué)上不宜用這種數(shù)據(jù)作瘧原蟲感染密度的定量分析。國內(nèi)常用此方法將密度分為六級(jí)： 1 . 全厚血膜查見

17、瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字； 2 . 全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲，記錄“少”； 3 . 100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野15個(gè)，記錄“+”； 4 . 100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野610個(gè)，記錄“+”； 5. 100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野11100個(gè)，記錄“+ ”； 6. 100個(gè)視野中查見的瘧原蟲數(shù)平均每個(gè)視野100個(gè)以上，記錄“+ ”。 2 厚血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù) 根據(jù)預(yù)先測定的白細(xì)胞數(shù)目計(jì)算出每微升血液中瘧原蟲的數(shù)目。在制作厚血膜的同時(shí)，使用Coulter計(jì)數(shù)器或血球計(jì)確定每微升血液中的白細(xì)胞數(shù)。然后鏡檢厚血膜，計(jì)數(shù)同一視

18、野中的瘧原蟲數(shù)和白細(xì)胞數(shù)，直到所計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)達(dá)到確定的數(shù)值為止(如果瘧原蟲密度較高，計(jì)數(shù)100200個(gè)白細(xì)胞即可，但在瘧原蟲密度很低時(shí)，計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)需達(dá)1000個(gè))。用下式算出瘧原蟲密度： 瘧原蟲數(shù)/白細(xì)胞數(shù)白細(xì)胞數(shù)/l血=瘧原蟲數(shù)/l血。 如果無法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，則可按常規(guī)估計(jì)白細(xì)胞數(shù)。國外最常采用的數(shù)值是8000白細(xì)胞/l血,國內(nèi)常用6000白細(xì)胞/l血。 3 薄血膜的瘧原蟲計(jì)數(shù) 根據(jù)紅細(xì)胞數(shù)目計(jì)算出每微升血液中瘧原蟲的數(shù)目，或根據(jù)紅細(xì)胞的瘧原蟲寄生率計(jì)算出瘧原蟲密度。在涂制薄血膜的同時(shí)，使用Coulter計(jì)數(shù)器或血球計(jì)確定每微升血液中的紅細(xì)胞數(shù)，如沒有計(jì)數(shù)，可按常規(guī)估計(jì)紅細(xì)胞數(shù)，一般男性按500萬個(gè)紅細(xì)胞/l血，女性按450萬個(gè)紅細(xì)胞/l血計(jì)算。先用油鏡檢查薄血膜，算出紅細(xì)胞的瘧原蟲感染率。按下式算出瘧原蟲密度:紅細(xì)胞瘧原蟲感染率紅細(xì)胞數(shù)/l血瘧原蟲數(shù)/l血 如果瘧原蟲密度較高，檢查1000個(gè)紅細(xì)胞即可，但瘧原蟲密度低時(shí)，則應(yīng)檢查更多的紅細(xì)胞。可按下列公式確定需檢查的紅細(xì)胞數(shù)：N=45.5(I-P)/P,N為需要檢查的紅細(xì)胞數(shù)，P為1萬個(gè)紅細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)，I為血樣單位(以1萬個(gè)紅細(xì)胞計(jì)算），45.5為常數(shù)