DB51/T1077—2010飼料中黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?的測定高效液相色譜法I前言 1范圍 12規范性引用文件 13原理 14試劑和溶液 1 1 27分析步驟 28結果計算 29精密度 3附錄A(資料性附錄) 4Ⅱ本標準的附錄A為資料性附錄。本標準由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標準由四川省質量技術監督局批準。本標準由四川省飼料工作總站負責起草。本標準起草人：柏凡、張靜、李云、馮婭、甄陽光、趙立軍。1飼料中黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?的測定高效液相色譜法本標準規定了測飼料中黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?的含量的高效液相色譜法(HPLC)。本標準適用于配合飼料、濃縮飼料及飼料原料的測定。本標準中黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?的檢出限分別為2.0μg/kg、0.8μg/kg、2.5μg/kg、1.5μg/kg。2規范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備試樣經乙腈-水提取，離心、過濾后，取濾液經過免疫親和柱凈化，濃縮，用高效液相色譜儀-柱后衍生-熒光檢測器檢測，外標法計算黃曲霉毒素B?、B?、Gi、G?含量。4試劑和溶液除特殊說明外，所有試劑均為分析純，色譜用水符合GB/T6682一級用水的規定。4.1甲醇：分析純、色譜純。4.4磷酸氫二鈉。4.6甲醇-水(70+30)提取液：量取甲醇700mL,加水300mL,混勻。4.7磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取8.0g氯化鈉、1.44g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀、0.2g氯化鉀，溶于1000mL水，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH7.4。4.8.1標準貯備液：精密量取1.0mL黃曲霉毒素混合標準溶液，用乙腈溶解、定容至10mL,此貯備液黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?濃度分別為200μg/L、50μg/L、200μg/L、50μg/L,置于冰箱中2℃~8℃保存，有效期6個月。4.8.2標準工作溶液：分別準確移取標準貯備液，用流動相配制成標準工作溶液，黃曲霉毒素B?、G?的濃度為1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L,黃曲霉毒素B?、G?的濃度為0.25μg/L、0.50μg/L、1.25μg/L、2.50μg/L、5.00μg/L、12.50μg/L,置于冰箱中2℃~8℃保存，有效期1個月。4.9黃曲霉毒素免疫親和柱。5儀器與設備25.1分析天平：感量0.1mg。5.2振蕩器。5.3離心機：轉速為5000r/min以上。5.4超純水處理器。5.5渦旋混合器。5.6高效液相色譜儀：配備熒光檢測器。5.7柱后光化學衍生器。5.8氮吹儀。5.90.45μm濾膜。6試樣制備按GB/T14699.1規定采集試樣后，按GB/T20195規定，選取具有代表性的實驗室樣品1kg,四分法縮減分取200g左右，粉碎過1mm孔篩，混勻裝入磨口瓶中備用。7分析步驟7.1試樣溶液的制備7.1.1提取稱取25g試樣(精確至0.01g)于錐形瓶中，加入125mL甲醇-水(70+30)提取液(4.6),振蕩提取40min,離心，取上清液過濾，準確量取濾液10mL,加入30mLPBS(4.7)稀釋，混勻，待凈化。7.1.2凈化取10mLPBS活化小柱，將上述10mL提取液以1-2滴/秒的速度通過免疫親和柱，用10mLPBS(4.7)水淋洗，抽干柱子，用1mL甲醇(4.1)洗脫。洗脫液60℃氮氣吹干，準確加入流動相(7.2.3)1.0mL,渦旋30s,過0.45μm濾膜，上機測定。7.2色譜條件7.2.1色譜柱：C?8柱，柱長250mm,內徑4.6mm,粒度5μm;或性能相當的色譜柱。7.2.2柱溫：30℃。7.2.3。7.2.5檢測器：熒光檢測器，Ex:370nm,Em:450nm。按上述色譜條件，分別將標準溶液和試樣溶液上級測定，按照保留時間進行定性，單點或多點校正外標法定量。8結果計算試樣中黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?的含量X,以質量分數微克每千克(μg/kg)表示，單點校正按式(1)計算：式中：V——上機定容體積，單位為毫升(mL);As——黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?標準溶液對應的色譜峰面積；A——試樣溶液對應的色譜峰面積；Cs——黃曲霉毒素B?、B?、G?、G?標準工作溶液的濃度，單位為微克每升(μg/L);3m——試樣質量，單位為克(g);n——稀釋倍數。結果用平行測定的算術平均值表示，保留