1、gP96多肽復合物樹突狀細胞疫苗的實驗研究gP96多肽復合物樹突狀細胞疫苗的實驗研究北京大學人民醫院胸部微創中心胸外科博士研究生： 李運導 師： 王俊 教授 研究背景全世界肺癌病例1910年gP96 or DC科研工作新問題單方面要素兩方面要素gP96多價性特異性（抗原庫）DC識別抗原激活細胞免疫（專職抗原呈遞細胞）研究內容肺癌組織提取gP96SDSPAGE凝膠電泳、銀染鑒定、Western印跡分析 蛋白定量分析RT-PCR檢測RNA水平表達免疫組化檢測蛋白水平表達第一部分 gp96多肽復合物提取鑒定 在肺癌組織中表達的研究肺癌組織gP96提取和鑒定；肺癌組織和正常組織gP96的表達水平；目的

2、流程定量分析測得所提取的gp96蛋白濃度在0.1g/ul左右，相當于50-80ug/g組織。肺癌組織細胞漿中有棕黃色顆粒聚集 正常肺組織中細胞蘇木素染色陰性 同一患者標本 GeneN (xs)T (xs)t valuep valuegp960.67250.47131.1100.4467-4.3180.001外周血單個核細胞提取及體外擴增流式細胞儀鑒定gP96與樹突狀細胞共孵育制備疫苗體外CTL反應，INF-濃度淋巴細胞表型分析第二部分 gP96多肽復合物/DC疫苗體外 誘導CTL反應實驗研究外周血來源DC培養和鑒定gP96多肽復合物/DC疫苗的制備gP96/DC體外實驗 目的流程培養2-3天后

3、的DC 培養7天后的DC A-1培養前CD1a- A-2. 培養后CD1a+ B-1. 培養前CD86- B-2. 培養后CD86+C-1. 培養前CD83- C-2. 培養后CD83+D-1. 培養前CD80- D-2. 培養后CD80+E-1. 培養前CD14+ E-2. 培養后CD14- CD14-；CD80+；CD83+；CD86+ 培養前淋巴細胞的CD3 培養10d后淋巴細胞的CD3培養前淋巴細胞的CD4、CD8 培養10d淋巴細胞的CD4、CD8CD3/CD8T細胞明顯增加；CD8/CD4細胞比例增加樣本ELISA反應的OD值(XS)釋放IFN-的量（pg/ml）gp96/DC2.

4、2440.1334150.835gp961.6740.1623066.847DC0.1260.011122.966建立動物模型以制備的疫苗免疫動物并種植腫瘤觀察成瘤率，腫瘤體積，動物生存時間第三部分 gP96多肽復合物/DC疫苗 動物體內實驗研究 gP96/DC在小鼠體內的抑制腫瘤生長作用的研究 目的流程LA795肺癌腫瘤組織提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響SCID小鼠PAa肺癌腫瘤組織提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC細胞觀察腫瘤生長情況及對小鼠生存期的影響100

5、%75%615小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積（xs cm）組數處理動物數腫瘤植入后天數212835種植102.630.876.461.478.041.40GP968 0.330.27 0.700.621.491.17DC8 0.300.22 0.640.491.160.92GP96+DC8 0.210.220.320.30 0.620.30615LA795：與組比較， P0.05。：與組和組比較，P0.05 ：與組比較， P0.05。：與組和組比較，P0.05 615小鼠腫瘤植入后的生存時間組數處理動物數腫瘤植入后生存天數種植1052GP968 51.5DC8 58.5GP96+DC8 77

6、SCIDPAa：與組比較， P0.05。：與組和組比較，P0.05 SCID小鼠腫瘤植入后不同時間的腫瘤體積(XScm)組數處理動物數腫瘤植入后天數212832重建160.380.120.750.300.900.33GP9680.090.06 0.170.060.220.11DC80.080.060.150.080.240.11GP96+DC80.030.03 0.080.080.120.1387.5%100%SCID小鼠腫瘤植入后的生存時間組數處理動物數腫瘤植入后生存天數重建1637GP96852DC852.5GP96+DC862討 論gP96在肺癌中的表達基因表達的檢測 mRNA水平：原位

7、雜交、Northern Blot、核酸酶保護分析 Real-time RT-PCR、半定量RT-PCR 。蛋白水平。 方法比較原位雜交 僅能提供mRNA在細胞內的定位信息，不能確定mRNA的含量，受人為因素影響大，無法檢測極微量的mRNA Northern Blot 敏感性低，樣品用量大，對實驗條件要求高，需要應用放射性物質，不適合檢測低豐度的mRNA Real-time RT-PCR 儀器和試劑盒價格昂貴，標準物難以獲得 核酸酶保護分析 操作復雜，價格昂貴 半定量RT-PCR 高度敏感、準確、簡便、快捷、對儀器要求低、可重復性強、易于掌握 與正常組織相比，肺癌組織中編碼gp96的基因在mRN

8、A水平的表達明顯增高的。這進一步證實了在罹患腫瘤時，以gp96為代表的HSPs合成明顯增加，這是機體受到腫瘤刺激產生的熱休克反應，以此來維持細胞內環境的穩定，是機體的一種保護性反應。 半定量RT-PCR法mRNA水平gP96肺癌組織正常肺組織免疫組化法蛋白水平引物設計循環次數操作中注意：模板內對照gP96的提取 提取gP96的經典方法（Srivastava）：飽和硫酸銨沉淀刀豆球蛋白A親和層析DEAE離子交換層析（提取率估計在20-30%，蛋白提取量在15-150ug/g組織 ）存在的普遍問題：蛋白提取率低 ，尚無法滿足臨床需要解決：更改其中的試劑或步驟： 去除飽和硫酸銨沉淀過程，離子交換層析

9、柱換用MonoQ或POROS20QE柱 增加組織中gP96含量： 熱刺激、缺氧等物理刺激或者通過轉基因技術導入gP96cDNA重組真核表達質粒以增加細胞中gP96合成量 DC的來源來源培養方法建立比較臍帶血 1992腫瘤患者多無法獲得 外周血 1994取材容易，操作簡單，DC生成量大，純度高，可以反復進行，患者痛苦小，便于臨床應用，是目前獲得DC的較理想的途徑。 骨髓 1995穿刺操作復雜，獲得細胞量少，需多點反復操作，可能會增加創傷，給患者造成極大的痛苦 DC的分離和培養分離純化DC的方法 物理方法 根據細胞的黏附性進行分離 黏附分離法、尼龍毛分離法和羰基碳分離法等 根據細胞比重進行分離 葡

10、聚糖-泛影葡胺（Ficoll）密度梯度離心、Percoll非連續性/連續性密度梯度離心及E花環沉淀分離等方法 免疫分選 淘洗法、流式細胞技術、磁性細胞分離術等方法 密度梯度離心獲取單個核細胞富集前體DC細胞因子體外擴增培養富集前體DC：去除粒、單核、T、B、NK和巨噬細胞方法特點黏附法直接黏附法對細胞干擾小，DC獲得率高間接黏附法培養體系小，節省細胞因子，細胞損傷大，DC獲得率低單抗法免疫磁珠和流式細胞技術需要大量的特殊抗體，細胞損失量大，價格昂貴，細胞因子 作用必需GM-CSF促進DC增殖，是最基本的因子IL-4抑制中性粒細胞和巨噬細胞增殖爭議TNF-促進DC成熟，抑制粒細胞產生 Flt3L

11、促進DC增殖，抑制DC分化其他LPS、CD40L、INF-、INF-及IL-1等方法備注形態結構相差顯微鏡、電鏡直觀分子表達CD1a、CD80、CD86、CD40和CD83等，特別是CD83-樹突狀細胞的標志性分子準確功能狀態混合淋巴細胞反應DC的鑒定關于動物腫瘤模型動物模型的優越性：避免了在人身上進行實驗所帶來的風險 臨床上少見疾病可用動物隨時復制出來研究周期短，節省時間，克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發病率低的缺點可在人為控制條件下進行實驗可以嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性 取材方便，可以簡化實驗操作和樣品收集成本低有助于更全面地認識疾病的本質 按產生原因 自發性腫瘤模型 實驗

12、動物未經任何有意識的人工處置，在自然情況下所發生的疾病 誘發性腫瘤模型 使用物理的、化學的和生物的致病因素作用于動物誘發腫瘤 移植性腫瘤模型 人類腫瘤移植動物按系統范圍 疾病的基本病理過程模型 各種疾病共同的一些病理變化過程的模型 各系統疾病模型 與人類各系統疾病相應的模型 按模型種類 整體 模型離體器官和組織 細胞株 分類已建立動物模型的人類腫瘤：肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、膠質瘤等常用的動物：小鼠、大鼠、兔、雞胚等近交系小鼠：BALB/c、C57、C3H、615、T739、裸鼠、SCID小鼠等五十余種SCID小鼠16號染色體近著絲點處單個隱性基因發生SCI

13、D突變基因重排異常免疫球蛋白重鏈T細胞抗原受體T、B淋巴細胞前體分化T、B淋巴細胞細胞免疫體液免疫免疫球蛋白缺如淋巴細胞嚴重減少對體外移植物免疫排斥低聯合缺陷+1983年Bosma免疫重建1988年Moiser骨髓胸腺脾胎肝外周血淋巴細胞腹腔皮下免疫系統恢復且具有人類免疫系統的特征與人體內環境極其類似保證了患者本身的安全帶有人類腫瘤具有人類免疫系統研究腫瘤生長的理想動物模型gP96/DC在體外可誘發強烈的CTL反應 在體內可有效抑制腫瘤生長 gP96+DC特異性+多價性避免了腫瘤的免疫逃逸探尋機制抗原肽（小分子）DCgP96+抗原肽CD91T淋巴細胞MHC分子、共刺激分子粘附分子體外擴增培養DC未成熟DC凋亡gP96成熟DC直接與T淋巴細胞接觸發生作用未接觸腫瘤抗原不需激活腫瘤抗原非專職抗原呈遞