1、基因工程復習歸納第一章 緒論1.基因工程的定義：是指按照人們的愿望，經過嚴密的設計，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體/宿主）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳、并表達出新的性狀的技術。2.基因工程概念的發展：遺傳工程DNA重組技術分子/基因克隆（Molecular/Gene基因工程基因操作。應用領域以“基因工程”、“DNA重組”為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達出胰島素1982：世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術誕生1989：我

2、國第一個基因工程藥物rhIFN1b上市2003: 世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒-p53上市3.基因工程的三大關鍵元件基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細胞，并能穩定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達載體）。宿主（受體）：，能攝取外源DNA、并能使其穩定維持的細胞（組織、器官或個體）。4.基因工程的基本步驟（切、接、轉、增、檢（大腸桿菌是中心角色）（1）目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。 （3）重組

3、體的轉化：將重組體（載體）轉入適當的受體細胞中。 （4）克隆鑒定：挑選轉化成功的細胞克隆（含有目的基因）。 （5）目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產物。 第二章 DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1. 限制性核酸內切酶(主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵)。限制性核酸內切酶的功能與類型主要特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結構異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識

4、別序列內距識別序列下游24-26bp處其中II型限制性核酸內切酶：切割位點專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。特點：1.識別、并切割雙鏈DNA分子中特異序列的DNA內切酶。2.識別序列為4-6堿基對的回文對稱結構（旋轉對稱結構）。3.單體蛋白、僅有限制性內切酶活性，無甲基化酶活性。4.切割產物末端：5突出末端、3突出末端、平頭末端.6.最適溫度：大多為37,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。8.當反應條件不適合時，識別和切割序列發生變化（星號反應）。星活性（star activity）：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星活性。引起星活性的因素：

5、高濃度甘油（>5%）、 酶過量（>100U/mg）、 低離子強度（<25mM） 高pH (>pH8.0)、 有機溶劑、 用其它二價陽離子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。 II型限制性核酸內切酶的命名具體規則是：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前兩個小寫字母構成酶的基本名稱，如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將株名的一個字母加在基本名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質粒上，則還需用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。酶名稱的最后部分為羅馬數字，表示在該生物體發現此酶的先后次序。例子：Eschericha（屬名）coli（種名）R

6、（質粒）大腸桿菌R質粒EcoR I EcoR VHaemophilus（屬名） influenzae（種名） d（株名） 嗜血流感桿菌d株- H i n d II H i n d III。羅馬數字表示同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶。特殊性質的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶識別相同序列，如HindIII HsuI: A / AGCTT同尾酶：是指識別位點不同，但切出的片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。同尾酶的切割產物互為粘性末端，并能連接，但連

7、接后二個酶的識別序列均被破壞。2.DNA連接酶（T4-DNA連接酶）功能：體外連接片段常用的連接酶： 連接酶參與連接反應的基團：端羥基和端磷酸基團，形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的基本性質 ：修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵、修復RNA-DNA雜合分子中DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵、連接多個平頭雙鏈DNA分子T4 DNA連接酶的活性單位定義：在 20l 反應體系中于 16 ，使 Hind 切過的 l DNA （300g/ml，0.12M 5' 末端）在 30 分鐘內連接 50% 所需的酶量為 1 個 NEB 單位。3.DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）基本性質

8、：1. 53的DNA聚合酶活性 2. 53的核酸外切酶活性 3. 35的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途：1.切口平移標記法 2.Nick translation 3.制備32P標記的探針。所有的DNA聚合酶中只有此酶有該反應。缺口平移標記原理見ppt。大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1. 補平由核酸內切酶產生的5粘性末端 2.DNA片段的同位

9、素末端標記 3.cDNA第二鏈的合成 4.雙脫氧末端終止法測定DNA序列。T4-DNA聚合酶基本特性：1.53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性(極強) 2. 在無dNTP時，可以從任何3-OH端外切 3.在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位基本用途：1.切平由核酸內切酶產生的3粘性末端，該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多。2.DNA片段的同位素末端標記。依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）基本用途：1. 以RNA為模板合成cDNA鏈 2.雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈4.核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外

10、切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（Exo）【特異性地從5 端外切】；單鏈核酸內切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）&大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）二、用于克隆的載體1. 載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增或表達的工具。載體應具備的條件： 1.具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）2. 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或

11、結合位點 3. 具有較高的外源DNA的載裝能力 4. 具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點(多克隆位點 ) 5. 具有合適的篩選標記 2.載體類型：（1）根據主要用途可以分為：克隆載體和表達載體克隆載體：主要用于在大腸桿菌細胞中克隆目的基因，或在大腸桿菌或釀酒酵母細胞中構建基因文庫。克隆載體關鍵元件：A.多克隆位點 B.篩選標記基因 C.復制起始位點表達載體：除含基因克隆所需元件外，還有供外源基因表達用的啟動子、終止子等順式元件，用于在特定的宿主中表達目的基因。（2）按傳代特性分：自主復制型載體：含復制子，可獨立于宿主染色體外復制與傳代（穿梭載體：裝有針對兩種不同受體的復制起點，便于基因克隆）

12、。整合型載體：不含復制子，需借助同源重組機制整合于宿主基因組。3.分子克隆載體常用類型：（1）質粒：15kb以下 嚴緊型復制控制的質粒：1 - 5 拷貝，如pSC101 松弛型復制控制的質粒：30 - 50 拷貝，如 ColE1氯霉素擴增：在宿主菌生長的中后期，通過添加氯霉素抑制蛋白質合成、關閉主要代謝途徑，以使松弛型質粒 迅速大量擴增（可達上千拷貝）的操作。質粒載體的特點：分子量小，便于操作；易于構建，可作為其他宿主系統載體的骨架；用途廣泛；缺點：裝載量小（小于10kb），不能用來克隆大片段。重要的大腸桿菌質粒載體：pBR322：松弛型復制；氯霉素可擴增；拷貝數 50 100 / cell；

13、用于基因克隆。還有pUC18/19；T載體，詳見ppt，了解一下。實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法：質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染；堿裂解法（最常用）：質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間；沸水浴法：質粒DNA純度底、快速、操作簡便。質粒的不相容性的分子機制兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，可導致子代細胞質粒組成不同，且這種差異具隨機性，經過若干代后宿主細胞中處于數量弱勢的質粒必然被淘汰，而僅剩強勢質粒。質粒載體不穩定性的類型分離的不穩定性：在細胞分裂過程中發生

14、的質粒不平均的分配，有的細胞沒有獲得質粒 DN拷貝，并最終增殖成為無質粒的優勢群體。結構的不穩定性：由轉位作用和重組作用所引起的質粒DN的重排與缺失。 影響質粒載體穩定性的主要因素新陳代謝負荷對質粒載體穩定性的效應；拷貝數差度對質粒載體穩定性的影響低差度-穩定 / 高差度-不穩定；寄主重組體系對質粒載體穩定性的效應形成重組質粒二聚體，便會以高出質粒單體分子兩倍的速度進行復制，從而導致出現質粒寡聚體的克隆增殖。（2）lamda噬菌體DNA:25kb噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體，由外殼包裝蛋白和l-DNA組成。DNA重組技術一般需要噬菌體進入溶菌狀態-DNA是線性雙鏈DNA分子，全長48502個

15、核苷酸。-DNA兩端各帶有一個12bp的粘性末端，稱為cos位點。噬菌體感染細菌以后，雙鏈DNA分子通過COS位點成環狀。插入型載體：改造后的長度正好為包裝的下限，因而本身也能被包裝，叫插入型載體1.cI基因失活：cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。2. Lac Z基因插入失活：在lac Z基因上有EcoR I位點，插入失活后利用X-gal法篩選（藍白篩選）。 取代型載體：長度為40kb，在非必需區域有酶切位點，距離為14kb。載量為10-25kb。用取代型載體克隆外源DNA可能需要經過哪些步驟？第一，應用適當的核酸內切限制酶消化載體，除去基因組中可

16、取代的DNA區段。第二，將上述所得的 DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對重組體的DN A分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的重組噬菌體。-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。-DNA作為載體的優點：1. -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌 2. -DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質粒的裝載量 3.重組l-DNA分子的篩選較為方便 4. 重組-DNA分子的提取較為簡便 5. -DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因。cos質粒：lamda DNA的cos區和質粒組成的載體: 31-45 kb（3）考

17、斯質粒載體的特點：1.能像-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞2.能像質粒那樣在受體細胞中自主復制 3. 重組操作簡便，篩選容易 4. 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 5. 不能體內包裝，不裂解受體細胞.（4）人工染色體載體人工染色體實際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質粒復制起始位點（ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。細菌人工染色體（BAC）:50-300kb,主要用于基因文庫構建易于發生重組、缺乏穩定性、制備工藝繁瑣 酵母人工染色體（YAC）: 350

18、-400kb，主要用于基因文庫構建克隆大型基因簇（gene cluster）結構&構建動植物基因文庫三、用于基因轉移的受體菌或細胞（1）受體（宿主）應具備的條件1.限制性缺陷型外切酶和內切酶活性缺陷（hsdR-） 2. 重組整合缺陷型用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA- ， recB-，recC- ）3. 具有較高的轉化效率 4. 具有與載體選擇標記互補的表型 5. 感染寄生缺陷型防止重組細菌擴散污染，生物武器除外。（2）各種基因工程受體（宿主）的特性A. 大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統完備，生長迅速，培養簡單，重組子穩定。適用于外源DNA的擴增和克隆、基因文庫的構建和外源

19、基因的高效表達，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌。產生結構復雜、種類繁多的內毒素。B. 枯草芽孢桿菌遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全 ，生長迅速，培養簡單，不產內毒素。遺傳欠穩定，載體受體系統欠完備。適用于重組蛋白與多肽、特別是微生物來源的酶的高效分泌表達。C.鏈霉菌抗生素的主要生產者，相對操作簡便，不產內毒素。遺傳不穩定，生長相對緩慢。主要用于抗生素生產菌株的改良。D. 酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養簡單，外源基因表達系統完善，遺傳穩定。內源性蛋白產物種類繁多且含量高。適用于外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構建、真核生物基因表達調控的

20、研究，是DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌。E. 昆蟲細胞（家蠶，桿狀病毒表達系統）具有真核生物的特征，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養成本低廉，遺傳穩定。DNA重組操作系統欠完善。適用于真核生物基因的高效表達。F. 哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞 CHO）與人的親緣關系近，表達系統完善，具有合適的糖基化修飾系統。細胞培養條件苛刻，生長緩慢。適用于哺乳類動物和人的基因表達調控研究、基因藥物的生產，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體。G . 植物細胞（擬南芥菜、煙葉） 農作物的經濟意義重大，轉基因植物細胞易于分化，細胞培養簡單且成本低廉，具有光合作用。遺傳操作繁瑣。適用于高

21、等植物基因表達調控的研究、基因藥物的生產，農作物品質的改良。實驗室常用的基因工程受體（宿主）：大腸桿菌；真菌：酵母菌（畢赤酵母，漢森酵母，啤酒酵母）&絲狀真菌（黑曲霉、青霉）；哺乳動物細胞 CHO （3）大腸桿菌轉化常用方法感受態（compentent )：受體(宿主）細胞經過一些理化或生物學方法處理后，細胞膜的通透性發生暫時性的改變，成為能允許外源DNA進入的一種生理狀態。感受態細胞（compentent cell )CaCl2法原理Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，轉化混合物中

22、的DNA與其形成抗Dnase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，后者經熱脈沖發生收縮作用，使細胞膜出現空隙，細菌細胞此時的狀態即為感受態。具體大腸桿菌感受態細胞的制備及質粒轉化詳見ppt。電轉化法 熱激法轉化率的定義：每微克DNA分子轉化宿主菌能獲得的轉化子數。例如，pUC18對大腸桿菌的轉化率為108，即每微克pUC18中只有108個分子能進入受體細胞。一微克pUC18共有3.4X1011個分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是說，每3400個pUC18分子才有一個分子進入受體細胞。 另一方面，在實際操作過程中，轉化一微克pUC18共需2ml感受態細胞，大約含有2X1010

23、個大腸桿菌細胞，也就是說，每200個細胞只有一個細胞能接納pUC18 DNA。 不同轉化方法轉化率：Ca2+誘導轉化106 107 / mg DNA 原生質體轉化105 106 / mg DNA -DNA轉染107- 108 / mg DNA 電穿孔轉化106 109 / mg DNA 轉化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。轉化子篩選和鑒定流程1、篩選選擇性平板篩選2、重組子初步鑒定顯色、PCR、比大小、酶切、分子雜交、生物/免疫學活性3、重組子確證DNA序列分析4、外源基因

24、表達產物檢測僅當外源基因克隆于特定表達載體和宿主中時才需要。常規基因克隆則否。轉化子篩選方法：抗藥性篩選法；營養缺陷型篩選法；顯色篩選法lacZ基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等；DNA電泳檢測【直接電泳檢測法；限制性酶切圖譜法；PCR擴增檢測法】；原位雜交法（高通量篩選）；DNA序列分析雙脫氧末端終止測序法；外源基因表達產物檢測法【聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）；酶聯免疫吸附法ELISA；免疫印記（Western blotting）；蛋白質生物功能測定法（高通量篩選）淀粉酶基因；原位免疫沉淀法（高通量篩選）；放射免疫原位雜交鑒定】四、基因克隆基

25、因文庫：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構建）。根據構建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）&cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）。在高度分化的生物體中cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫基因克隆常用方法：鳥槍法基本策略：染色體DNA的切斷：超聲波處理片段長度均一，大小可控，平頭末端；全酶切片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控；部分酶切片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。與載體連接：如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則

26、選擇表達型載體。轉化受體細胞如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞。篩選含有目的基因的目的重組子：菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立）。cDNA法基本策略：【cDNA第一鏈的合成cDNA第二鏈的合成（自身引導法、置換合成法、引導合成法、）】/雙鏈cDNA的克隆 離目的基因（完備分離程序、特異分離程序、差異分離程序）PCR法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據該序列化學合成聚合反應必需的雙引物基本策略：由Taq DNA聚合

27、酶擴增的PCR產物中，其3末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為Taq DNA聚合酶對dATP具有優先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆。化學合成法（全基因合成）基因文庫的完備性是指：在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數N之間的關系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率，f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小。基因文庫的構建程序1.基因組DNA的制備：2.基因組D

28、NA的切割：用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和制性內限切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區；第二，保證DNA片段大小均一。連接前，上述處理的DNA片段必須根據載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體3.載體和受體的選擇：出于壓縮重組克隆的數量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的-DNA或考斯質粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體。cDNA文庫構建的載體通常選質粒；用于基因文庫構建的受體則根據載體使用大腸桿菌或酵母菌。4.從基因文庫中篩選目的基因：可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩

29、選法、酵母雙雜交技術等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟。原位雜交法。第三章 大腸桿菌基因工程一、大腸桿菌表達（生產）系統的優缺點大腸桿菌表達系統的優點1.遺傳背景清楚（4405個ORF），便于基因操作 2.表達水平高，遺傳較穩定3.優良的工業性能：繁殖迅速、培養簡單、操作方便 4. 被美國FDA認定為安全的重組藥物生產系統大腸桿菌表達系統的缺點1. 缺乏翻譯后修飾加工系統（不能表達糖基化蛋白、結構復雜的蛋白等）2.胞內缺乏高效的表達產物折疊機制（形成包涵體），分泌機制不完善 3.細胞周質內含有種類繁多的內毒素二、大腸桿菌系統高效表達原理大腸桿菌系統表達載體的基本元件A、目的基

30、因：編碼外源蛋白的結構基因 B、轉錄元件：啟動子、終止子C、翻譯元件：核糖體結合位點、翻譯起始位點D、克隆元件：克隆位點、復制原點、標記基因E、翻譯后元件（非必須） ：信號肽、融合肽外源基因在大腸桿菌中高效表達原理A、啟動子 (Promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并能起始RNA合成的序列。是基因表達最關鍵和最強的表達調控元件，啟動子的強弱對表達水平有決定性影響。（沒有啟動子，基因就不能轉錄）。啟動子有種屬特異性（如真核的在原核宿主中無效），有組成型（組成型表達系統）和誘導型（誘導型表達系統）二大類。原核基因啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成：（1）Pribno

31、w盒，位于轉錄起始位點上游510bp，一般由68個堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或10區。（2）35區，位于轉錄起始位點上游35bp處，故稱35區，一般由10個堿基組成。常用原核基因啟動子：【lac (乳糖啟動子)；trp (色氨酸啟動子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子Ptac = Ptrp 的-35區+ Plac的-10區）；T7啟動子】IPTG誘導；PL和PR(噬菌體的左向和右向啟動子)溫控（熱誘導），30/37培養， 42誘導。T7啟動子最成功的啟動子 A.強大的 T7 啟動子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，B.T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌RN

32、A 聚合酶的快 5 倍 C.由于大腸桿菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要將外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5啟動子控制下，IPTG間接誘導）。B、終止子轉錄過頭現象：A.RNA聚合酶滑過終止子結構繼續轉錄質粒上鄰近的 B.DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物。防止轉錄過頭策略：A、采用強終止子大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2T7&噬菌體DNA上的T B、二聚體終止子串聯的特殊結構C、核糖體結合位點（RBS） mRNA 5端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。SD序列（

33、Shine-Dalgarno）：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列（5UAAGGAGG 3），它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區域3AUUCCUCC 5并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯。D、質粒拷貝數 策略：較低拷貝質粒（幾個至數十個）& 調控重組質粒的擴增E密碼子 滿足宿主對密碼子偏愛性的策略:外源基因全合成 & 同步表達相關tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構建策略1、包涵體型異源蛋白的表達包涵體：胞內高效表達時，工程菌因大量合成異源蛋白質所形成的水不溶性積聚物。性質：致密（密度大于細胞碎片和所有細胞器）、還含有標記

34、蛋白、RNA聚合酶和少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。裸露或被膜包裹。包涵體形成原因：大腸桿菌細胞內呈“還原”型環境，不不利于二硫鍵的形成，當高效表達時，新合成肽形成二硫鍵的速度和折疊效率跟不上合成速度。表達產物結構形式：a)部分屬于折疊過程中的產物；b)部分為無序卷曲與聚集，分子內二硫鍵錯配; c)分子間存在大量錯配二硫鍵。以包涵體形式表達目的蛋白的優缺點包涵體表達形式的優點：、便于表達產物分離包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來、利于表達產物在宿主細胞內穩定存在在形成包涵體之后，大腸桿菌的

35、蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白的穩定性已構不成威脅包涵體表達形式的缺點：以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變復性操作的效率對目標產物的收率至關重要。然而，這也是一個技術難題，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數目較高時，體外復性蛋白質的成功率相當低，一般不超過30%。包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復性途徑中。常采用高濃度變性劑：8M尿素、6MGuC打開各種次級鍵，以DTT等巰基試劑打開二硫鍵。能有效促進

36、包涵體溶解變性的試劑和條件包括：促溶劑 最常用, 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應表面活性劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復性和純化混合溶劑 如尿素與醋酸、二甲基砜等聯合使用，溶解力增強極端pH 廉價，但許多蛋白質在極端pH條件下發生修飾反應包涵體的復性與重折疊：二硫鍵形成（將多肽鏈中被拆開的游離巰基氧化重新形成二硫鍵（關鍵）；通過次級鍵的形成使蛋白質重折疊形成二硫鍵的方式主要有：A化學氧化法需要電子受體，最廉價的電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機的，僅適用于那些不含游離半胱氨酸殘基的蛋白質的重折疊 B二硫鍵交換需要還原型和氧化型谷

37、胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，因此適用性較廣，重折疊效果好包涵體復性操作的方法：緩慢降低變性劑濃度，并盡量減低蛋白濃度。詳見老師ppt。包涵體的復性與重折疊的主要挑戰是： 聚集沉淀2、融合型異源蛋白的表達以融合形式表達目的蛋白的優缺點目的蛋白穩定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件 目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內形成良好的空間構象，且大多具有水溶性 缺點：融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。

38、在實際生產中，產品主要的成本往往就在該工段用于融合蛋白構建的Tag（5種）A、His6 易于親和層析、不影響目的蛋白結構、無免疫原性 B、谷胱甘肽轉移酶（GST） 維持良好空間構象 C、硫氧化還原蛋白（TrxA） 維持良好空間構象 pTrxFus D、麥芽糖結合蛋白（MBP） 促進分泌 E、內含肽（Intein)：類似內含子的多肽，與目的能蛋白融合表達，在表達后可進行自剪接，兼有蛋白酶和蛋白連接酶的特性。4、DTT條件下切割。目的蛋白的回收化學裂解法-溴化氰（CNBr）法原理： CNBr與Met的硫醚基反應，生成高絲氨酸(HMS)殘基留于上游肽段C端基因操作：在二個多肽基因融合處設置Met的密

39、碼子酶促裂解法原理：利用蛋白酶的專一性識別殘基與位點切開融合肽基因操作：在二個多肽基因融合處設置蛋白酶識別殘基的密碼子常用多殘基識別位點蛋白酶Thrombin(凝血酶） Leu-Val-Pro-ArgGly-SerEnterokinase（腸激酶） Asp-Asp-Asp-Asp-LysFactor Xa （X因子） Ile-Glu/Asp-Gly-ArgPreScission（5切割！GE） Leu-Glu-Val-Leu-Phe-GlnGly-Pro TEV protease（Invitrogen) Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlnGlyIntein（內含肽，自切割，NEB）

40、 dithiothreitol cleavage ！3、分泌型異源蛋白的表達蛋白質的分泌機制A、 在信號肽牽引下跨膜，進入周質腔；B、信號肽酶切下信號肽，釋放目的蛋白于周質腔。以分泌形式表達目的蛋白的優缺點A、分泌表達形式的優點：目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質為氧化型環境，利于二硫鍵形成）目的蛋白穩定性高（周質腔蛋白酶少）目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 B分泌表達形式的缺點：相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達，少數外源基因即便能分泌表達，但其表達水

41、平通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產業化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。主要用于實驗室小規模制備。4、寡聚型異源蛋白的表達以寡聚形式表達目的蛋白的優缺點 穩定表達小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結構，易受蛋白酶攻擊，易降解，串聯短肽具有與蛋白質相似的長度及空間結構，可抗蛋白酶降解。目的蛋白高效表達在不提高質粒拷貝數的前提下，增加目的基因的拷貝數 目的產物回收困難四、工程菌構建、分析、發酵與產物分離純化(1)工程菌構建與分析(2)工程菌遺傳穩定性分析 在非選擇條件下連續傳代數代后，對工程菌重組質粒存在狀況、結構完整性和功能完整性進行一下三項分析： A、存在狀況：宏觀逃逸率

42、B、結構完整性：酶切圖譜分析、序列分析 C、功能完整性：表達水平工程菌遺傳不穩定性的表現形式分配不穩定性（主要）：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）結構不穩定性：重組DNA分子上某一區域發生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失重組質粒的逃逸：工程菌部分細胞因質粒丟失而不再攜帶重組質粒的現象。重組質粒逃逸的原因目的基因本底表達產物引起的毒性反應關閉質粒DNA合成途徑，啟動降解程序目的基因高效表達誘導宿主細胞產生應激反應 抗性標記基因過表達，抗生素消耗過快。目的基因表達盒“轉錄過頭”，影響Ori區域。環境因素誘導的重組質粒滲漏高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料

43、（吖啶）重組質粒的宏觀逃逸率：工程菌培養液中丟失質粒的細胞占細胞總數的百分比。 宏觀逃逸率（%）=（非選擇性平板菌落數選擇性平板菌落數）/非選擇性平板菌落數×100(3)發酵工藝研究工程菌生長與表達主要影響因素1、培養基：影響菌體生長、質粒穩定性、表達水平、產物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應避免外源基因表達的“葡萄糖效應”。氮源：有機氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿 無機氮： 氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等 其他：無機鹽、微量元素維生素、生物素等2、菌齡與接種量菌齡：自接種起培養的時間（小時） 影響停滯期、質粒宏觀逃逸率接種量：是指接入的種子液體積占培

44、養液體積的百分比 過小：延長菌體停滯期，質粒宏觀逃逸率高過大：菌體生長過快，代謝產物積累過多，抑制后期菌體的生長，降低表達水平。3、pH值、溫度與溶解氧 pH值：影響生長速度、表達水平和產物可溶性。生長最適pH范圍在6.8-7.4，表達最適pH為6.0-6.5 溫度：影響生長速度、表達水平和產物可溶性。生長最適37，較低溫度利于可溶表達。溶解氧：影響生長速度和表達水平4、誘導時機與收菌時機誘導時機：過早影響生物量、過晚影響表達水平。一般在生長曲線對數中期或對數后期進行誘導收菌時機：過早影響表達水平、過晚影響產物穩定性、可溶性、并造成浪費。一般在表達曲線平臺期（誘導后3-4小時）收菌工程菌搖瓶水

45、平生長與表達試驗主要研究參數：培養基、接種量、pH值、溫度、誘導與收菌時機等主要觀察指標： 表達水平（%）、生物量、表達產物積累（包涵體形成）情況、質粒宏觀逃逸率等結果：生長曲線與表達曲線(4)工程菌工業發酵工藝研究工程菌發酵工藝基本要求與重點問題：基本要求：高表達、高生物量、便于放大、低成本重點問題：1）質粒穩定性問題2）表達與生長的矛盾問題（誘導時機）3）發酵方式問題：分批式or流加式發酵？常規發酵or高密度發酵？發酵方式： 1）批式發酵：較常用，高表達、但菌體量較少。 2）流加發酵：較常用，主要補充碳源，菌體量大、表達水平下降，碳源流加時機和速度是關鍵。 高密度發酵：無機鹽介質，通過碳源

46、限制和流加實現高密度發酵。 3）連續發酵：少用，高表達、高總生物量、難控制。 工程菌工業發酵工藝流程（如圖所示）：(5)表達產物分離純化工藝研究表達產物分離純化原則：1）要建立一個方便靈敏的蛋白檢測方法，以估價每一步的提純程度；2）分離步驟要盡可能少，每一步便于工業放大；3）盡量采用柱層析技術，各步驟間樣品應無需復雜處理；4）初步分離要快速、大規模，精純要高分辨率；5）盡可能避免帶入有害物質;6）每步需統計：得率、純度、純化倍數分離提純有三步策略：粗提、中度純化、精細純化 以下是粗提的圖示第四章 非腸道原核細菌基因工程芽孢桿菌基因工程1、芽孢桿菌表達系統的優、缺點優點：1、強大的分泌功能：如蛋

47、白酶、淀粉酶，20g/L 2、不形成包涵體，產物可正確折疊 3、非病原菌，無內毒素和外毒素，被美國FDA認定為GRAS（總體安全）系統 4、容易操作，背景清楚 5、易于培養、生長旺盛缺點：同源蛋白表達高（g/L)、異源蛋白低(mg/L)2、大腸桿菌與芽胞桿菌在表達外源基因方面的比較 大腸桿菌芽胞桿菌模式生物是否革蘭氏染色G-G+表達產物的分泌功能極少大多數包涵體形成不形成表達水平高對同源蛋白高，異源蛋白較低生物安全性高高分離純化過程復雜：復性、去內毒素簡單糖基化修飾無無3、高效表達原理1）異源啟動子：大腸桿菌系統的啟動子結構與芽孢桿菌的高度相似，異源啟動子有效2）短小芽孢桿菌胞壁蛋白

48、操縱子調控元件：中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白基因組成一個操縱子（cwp），由啟動子、SD序列和分泌信號肽序列組成的5端（0.6kb)序列可用于外源基因分泌表達。調控機制：完整的胞壁阻遏轉錄，生長平臺期胞壁蛋白的脫落和介質中的低濃度的Mg+誘導（去阻遏）。3）利用枯草芽孢桿菌胞外果聚糖酶操縱子調控元件果聚糖酶操縱子（sacB）由啟動子PsacB 、上游正調控序列DegQ和SacU、果聚糖酶基因(sacX)、下游終止子樣序列和抗終止蛋白SacY基因組成。第五章 真菌基因工程一、真菌表達系統的優缺點具有原核系統的操作簡便、分子生物學背景清楚的優點，具有真核系統蛋白翻譯后加工和分泌系統大規模發酵歷史悠

49、久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉不含有特異性的病毒、不產內毒素，為GARS系統缺點：產物糖基化位點和結構特點與高等真核的有差距二、釀酒酵母載體系統1、野生型質粒：2質粒（釀酒酵母）2、人工構建質粒: 5種 酵母附加型質粒（YEp） 酵母復制型質粒（YRp） 酵母著絲粒質粒（YCp) 酵母人工染色體（YAC） 酵母整合型質粒（YIp）3、標記：營養缺陷型的互補基因/抗性基因宿主細胞：為氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突變子，主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA-載體：攜帶相應的合成基因，如：leu1/leu2、trp1、his3/his4 、ura3選擇壓力：不完全培養基，如：YNB、無機鹽

50、培養基4、酵母菌轉化方法A、原生質體轉化法：細胞：去壁的原生質體原理：以PEG等滲緩沖液穩定原生質體，以Ca2+誘導細胞攝取外源DNA。特點：30%以上為多質粒共轉化轉化效率：可達原生質體總數的1-2%，但操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約。B、堿金屬離子介導轉化法：細胞：帶壁的完整細胞原理：通過堿金屬離子（如Li+等）、PEG和熱休克處理誘導細胞吸收外源DNA。特點：方法簡便，容易掌握，實用性強；吸收線型DNA的能力明顯大于環狀DNA，兩者相差80倍；共轉化現象極為罕見。C、電激轉化法：細胞：帶壁完整細胞或原生質體原理：通過電脈沖對細胞膜造成DNA攝取通道特點：轉化率高（10

51、5 / mg DNA）、操作簡便、適用范圍廣5、用作外源基因表達的酵母宿主菌釀酒酵母：最成熟的真核細胞表達系統，表達水平低，產物過度糖基化甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表達水平高，產物糖基化更合理畢赤酵母：巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）漢遜酵母：多型漢遜酵母（Hansenula polymorpha）其它酵母：已有60多種酵母菌建立了轉化系統 乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)6、釀酒酵母糖基化系統糖基化位點：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天門冬酰

52、氨酸殘基上的酰胺氮進行糖基化，對蛋白質的折疊、穩定性及活性較重要。 O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進行糖基化三、甲醇酵母表達系統1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子：指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母，如：畢赤酵母、 漢森酵母、假絲酵母甲醇氧化酶啟動子： A、目前已發現的、最強的真核啟B、嚴謹調控型啟動子： AOX1：甲醇誘導，葡萄糖阻遏，甘油脫阻遏 MOX：甲醇誘導，葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏2、甲醇酵母表達系統的優缺點A、表達水平高（最高水平的系統）B、產物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150個甘露糖）D、產物可正確折疊和高效分泌（最高

53、分泌表達系統）E、可利用簡單無機鹽培養基高密度發酵，生物量大。F、實驗室和工業操作簡單G、不能滿足結構要求嚴格的糖基化3、甲醇酵母二大宿主系統主要特點項目 畢赤酵母 漢遜酵母最適溫度 30 37最適pH值 4.5 4.5甘油阻遏 是 否糖基化 部分過度 較正常高密度發酵 100g/L 100g/L 選擇標記 his4、G418、 Zeocin、Cu+ leu2、 his3 、ura3、 G4184、畢赤酵母系統表達載體與整合模式5、多拷貝整合重組子篩選必要性： 目的基因表達盒的多拷貝整合是高效表達的基礎，但多拷貝整合是低概率事件（1-10%）G418抗性篩選： 表達載體引入卡拉霉素基因（Kan

54、amycin）作二級篩選標記，從His4+轉化子中篩選高G418抗性轉化子，抗性越高整合拷貝數越高。雜交篩選：菌落原位或Dot-Blotting雜交篩選 6、His+轉化子甲醇表型篩選必要性： A、不同目的基因的表達偏愛不同甲醇表型B、工程菌表達誘導條件的優化需要依據甲醇表型C、限切酶線性化方式誘導靶向整合（下表），但即使非AOX1取代型整合方式，也有可能因同源重組而破壞AOX1基因，產生MutS表型。線性化位點（限切位點）整合事件（位點）GS115株（AOX1野生）KM71株（AOX1缺失）SalI or StuI插入，his4His+Mut+His+MutsSacI插入，5AOX1His+Mut+His+MutsNotI or BglII取代，AOX1His+Muts His+Mut+Arg-7、轉化子PCR鑒定必要性： 證明外源基因確實整合在宿主基因組DNA，并排除意外丟失目的基因（機理不明）的 His+表型轉化子。PCR鑒定：以GS115的His