1、細胞工程應用的原理和方法研究的水平研究的目的細胞生物學和分子生物學細胞水平或細胞器水平按照人們的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得細胞產品概念分類植物細胞工程動物細胞工程理論基礎細胞的全能性主要技術植物組織培養植物體細胞雜交動物細胞培養動物細胞融合單克隆抗體技術胚胎移植核移植植物細胞工程技術動物細胞工程技術所采用技術的理論基礎 植物細胞工程通常采用的技 術 手 段 植物組織培養植物組織培養 植物體細胞雜交植物體細胞雜交植物細胞的全能性植物細胞的全能性（一） 細胞的全能性1、定義： 具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細胞都具有發育成完整生物體的潛能。胞都具有發育

2、成完整生物體的潛能。 2、原理： 生物體的細胞一般地包含有該物種所特有生物體的細胞一般地包含有該物種所特有的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個的每一個活細胞都應該具有全能性。都應該具有全能性。 3、差異： （1 1） 受精卵的全能性受精卵的全能性最高 （2 2） 受精卵分化后的細胞中，體細胞受精卵分化后的細胞中，體細胞的全能性比生殖細胞的的全能性比生殖細胞的低。 植物細胞的全能性植物細胞的全能性受精卵生殖細胞體細胞4、大小5.細胞表現出全能性的條件細胞表現出全能性的條件 離體狀態

3、離體狀態 有一定營養物質、激素和其他外界條件有一定營養物質、激素和其他外界條件 思考討論：為什么體內細胞沒有表現出思考討論：為什么體內細胞沒有表現出全能性，而是分化成為不同的組織、器官？全能性，而是分化成為不同的組織、器官？ 基因在特定空間和時間條件下基因在特定空間和時間條件下選擇性表達選擇性表達的結果。在個體發育的不同時期，生物體不同的結果。在個體發育的不同時期，生物體不同部位的細胞表達的基因是不同的，合成的蛋白部位的細胞表達的基因是不同的，合成的蛋白質也不一樣，從而形成了不同的組織和器官。質也不一樣，從而形成了不同的組織和器官。植物組織培養關鍵詞：關鍵詞：外植體、脫分化、再分化、愈傷組織外

4、植體、脫分化、再分化、愈傷組織細胞離體、一定的營養物質、細胞離體、一定的營養物質、激素和其他外界條件激素和其他外界條件必要條件：必要條件：植物組織培養植物組織培養 外植體：從活植物體上切下進行培養的那部分組織或器官外植體：從活植物體上切下進行培養的那部分組織或器官 1 1）外植體滅菌消毒（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等）外植體滅菌消毒（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等） 2 2）用消毒過的器械將外植體置于培養皿上）用消毒過的器械將外植體置于培養皿上 3 3）切取所需的外植體）切取所需的外植體 4 4）將外植體接種于培養容器的培養基上）將外植體接種于培養容器的培養基上 整個試驗在超凈工作臺上進

5、行，保持無菌！整個試驗在超凈工作臺上進行，保持無菌！ 外植體經過一段時間在培養基上生長后，會形成愈傷組織外植體經過一段時間在培養基上生長后，會形成愈傷組織植物組織培養的培養基植物組織培養的培養基 定義：含有一定營養成分，供組織培養植物生長定義：含有一定營養成分，供組織培養植物生長的基質的基質 無機營養成分：無機營養成分：C C，H H，O O大量元素及部分微量元大量元素及部分微量元素素 有機營養成分有機營養成分 含含N N物質：包括維生素和氨基酸物質：包括維生素和氨基酸 碳源：碳源：2%2%5%5%的蔗糖的蔗糖 瓊脂：起支持作用瓊脂：起支持作用 激素：生長素，細胞分裂素和赤霉素激素：生長素，細

6、胞分裂素和赤霉素 PHPH值：值：5.05.06.06.0過程離體的植物器官、組織或細胞離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化脫分化植物激素：植物激素：細胞分裂素、生長素細胞分裂素、生長素再分化再分化植物組織培養植物組織培養條件植物組織培養條件： 含有全部營養成分的含有全部營養成分的培養基、一定的溫度、空培養基、一定的溫度、空氣、無菌環境、適合的氣、無菌環境、適合的PHPH、適時光照等。適時光照等。（三） 植物體細胞雜交1 1、定義：、定義： 用兩個來自不同植物的體細胞融合成用兩個來自不同植物的體細胞融合成一個雜種細胞，且把雜種細胞培育成一個雜種細胞，且把雜種細胞培

7、育成新的植物體的方法。新的植物體的方法。 2 2、優勢：、優勢：（與有性雜交與有性雜交方法比較）方法比較） 打破了不同種生物間的生殖隔離限制，打破了不同種生物間的生殖隔離限制，大大擴展了可用于雜交的親本組合范大大擴展了可用于雜交的親本組合范圍。圍。植物體細胞雜交植物體細胞雜交去壁去壁去壁去壁纖維素酶纖維素酶果膠酶果膠酶原原生生質質體體植物細胞植物細胞原生質體融合原生質體融合離心、離心、振動、振動、電刺激、電刺激、聚乙二聚乙二醇醇再生細胞壁再生細胞壁雜種細胞雜種細胞去去分分化化愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株激素激素篩選篩選等量等量激素激素再分再分化化植物體細胞雜交植物體細胞雜交植物植物A A細

8、胞細胞植物植物B B細胞細胞去壁去壁原生質體原生質體A A原生質體原生質體B B原生質體融合原生質體融合融合體融合體再生壁再生壁雜種細胞雜種細胞細胞分裂細胞分裂愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株去壁的常用方法：去壁的常用方法：酶解法（纖維素酶、果膠酶等）酶解法（纖維素酶、果膠酶等） 原生質體融合方法原生質體融合方法：物理法：離心、振動、電刺激等物理法：離心、振動、電刺激等 化學法：聚乙二醇（化學法：聚乙二醇（PEGPEG） 植物體細胞雜交植物體細胞雜交制備原生質體制備原生質體：酶解法去掉細胞壁 誘導融會 新的原生質體新的原生質體 生出細胞壁 雜種細胞雜種細胞 組織培養 雜種植株雜種植株意義：克服

9、遠緣雜交不親和的障礙、培育新品種意義：克服遠緣雜交不親和的障礙、培育新品種幾個概念： 愈傷組織：離體的植物器官、組織或細胞，在培養一段時間以后，通過細胞分裂，形成一種高度液泡化、無定形狀態薄壁細胞組成的排列疏松無規則的組織。植物細胞的脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，又稱去分化。植物細胞的再分化：脫分化產生的愈傷組織在培養過程中重新分化根或芽等器官的過程。1.微型繁殖微型繁殖 (1)微型繁殖技術:快速繁殖優良品種的植物組織培養技術. (2)特點: 保持優良品種的遺傳特性; 高效快速地實現種苗的大量繁殖.2.作物脫毒 (1)材料:無病毒的莖尖 (2)脫毒苗:切取莖尖進行

10、組織培養獲得3.神奇的人工種子 (1)特點: 后代無形狀分離 不受氣候,季節和地域限制 (2)技術:植物組織培養. (3)結構:人工薄膜胚狀體或不定芽或頂芽或腋芽.1.單倍體育種(1)方法:花藥的離體培養(2)優點:后代穩定遺傳,都是純合體;明顯縮短育種年限.2.突變體的利用 (1)產生:植物組織培養 (2)利用:篩選對人們有利突變體,進而培育新品種1.種類:蛋白質,脂肪,糖類,藥物,香料,生物堿等.2.技術:植物的組織培養.動物細胞培養動物細胞培養動物細胞融合動物細胞融合單克隆抗體技術單克隆抗體技術核移植核移植動物動物細胞細胞工程工程常用常用技術技術動物細胞工程2 2、動物細胞培養的應用和概

11、念：、動物細胞培養的應用和概念： 動物細胞培養就是從動物有機體中動物細胞培養就是從動物有機體中取出相關的組織取出相關的組織, ,將它分散成單個細胞將它分散成單個細胞, ,然后然后, ,放在適宜的培養基中放在適宜的培養基中, ,讓這些細胞讓這些細胞生長和增殖生長和增殖. .一、動物細胞培養一、動物細胞培養1.發展歷史:3、動物細胞的培養過程、動物細胞的培養過程 幼齡動物幼齡動物取動物器官取動物器官和組織和組織剪碎組織剪碎組織胰蛋白酶處理胰蛋白酶處理細胞培細胞培養養單個細胞單個細胞動物細胞培養技術動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎是其他動物細胞工程技術的基礎3、動物細胞培養過程：動物胚胎

12、或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養50代細胞傳代培養細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養液遺傳物質未改變遺傳物質已改變動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維） 思考討論：思考討論：在動物細胞培養過程中，在動物細胞培養過程中，為什么要用胰蛋白酶對取出的動物組為什么要用胰蛋白酶對取出的動物組織進行處理？織進行處理？ 胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的膠原纖維和細胞外的其組織細胞間的膠原纖維和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。他成分酶解，獲得單個細胞。 有關概念

13、有關概念: 原代培養：原代培養：從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。初次培養稱為原代細胞培從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。初次培養稱為原代細胞培養。養。 傳代培養：傳代培養：將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養。有關概念有關概念細胞株：細胞株：原代細胞一般傳至原代細胞一般傳至1010代左右細胞代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存活到活到40504050代，這種傳代細胞為細胞株。

14、代，這種傳代細胞為細胞株。 細胞系：細胞系：細胞株傳代至細胞株傳代至5050代后又出現細胞代后又出現細胞生長停滯狀態，只有部分細胞由于遺傳物質的生長停滯狀態，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養條件下可以無限制傳代，這改變，使其在培養條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。種傳代細胞為細胞系。 細胞株和細胞系的區別細胞株和細胞系的區別： 細胞系的遺傳細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養。容易傳代培養。3.3.動物細胞培養的條件動物細胞培養的條件: :1.1.無菌無毒的環境無菌無毒的環境2.2.營養營養3.3.溫度

15、和溫度和pHpH4.4.氣體環境氣體環境 4.4.動物細胞培養技術的應用動物細胞培養技術的應用: : 1.1.蛋白質生物制品的生產蛋白質生物制品的生產 如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 2.2.健康細胞培養健康細胞培養 培養健康細胞用于燒傷病人皮膚移植培養健康細胞用于燒傷病人皮膚移植 3.3.細胞的生理、藥理、病理研究細胞的生理、藥理、病理研究 植物組織培養和動物細胞培養的比較比較項目比較項目植物組織培養植物組織培養動物細胞培養動物細胞培養原理原理細胞的全能性細胞的全能性細胞增殖細胞增殖培養基性質培養基性質固體培養基固體培養基液體培養基液體培養基培養基特有成培養基特

16、有成分分蔗糖蔗糖 植物激植物激素素葡萄糖葡萄糖 動物血動物血清清培養結果培養結果植物體植物體細胞株、細胞細胞株、細胞系系培養目的培養目的快速繁殖、培快速繁殖、培育無病毒植株育無病毒植株獲得細胞或細獲得細胞或細胞分泌蛋白胞分泌蛋白2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養材料？1、動物細胞培養液的主要成分是什么？較植物組培培養基有何獨特之處？3、為什么培養前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養能否像綠色植物組織培養那樣最終培養成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養基 2、成分中有動物血清因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛

17、，分裂能力強成塊組織不利培養，分散了做成細胞懸浮液利于培養不能，動物細胞培養只能使細胞數目增多，不能發育成新的動物個體二、動物體細胞核移植技術和克隆動物 動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發育為動物個體.核移植技術1.克隆羊培育過程黑面綿羊去核卵細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利胚胎移植技術胚胎移植的基本程序如下（以牛胚胎移植為例）2.體細胞核移植技術的應用前景3.體細胞核移植技術存在的問題一、動物細胞融合一、動物細胞融合 細胞融合是正常的生

18、命活動細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合兩個細胞正在融合 受精作用受精作用動物細胞融合細胞融合與融合誘導細胞融合物質：細胞融合與融合誘導細胞融合物質： 因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質分子和脂因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合，不滅質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合，不滅活的話會感染細胞，而不能誘導細胞融合。活的話會感染細胞，而不能誘導細胞融合。 細胞融合技術應用于哪些方面？細胞融合技術應用于哪些方面？ 細胞學、遺傳學、免疫學及制備單克隆抗體。細胞學、遺傳學、免疫學及制備單克隆抗體。二、單克隆抗體二、單克隆抗體什么是抗體？什么是抗體

19、？抗體是機體受抗原刺激后產生的、并能抗體是機體受抗原刺激后產生的、并能與該抗原發生特異性結合的具有免疫功與該抗原發生特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。能的球蛋白。漿細胞產生抗體。漿細胞產生抗體。B B淋巴細胞與抗體的關系：淋巴細胞與抗體的關系：B B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產生抗淋巴細胞受抗原刺激后，可以產生抗體。體。動物體內的動物體內的B B淋巴細胞可以產生百萬種淋巴細胞可以產生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。特異性免疫作用。每一個淋巴細胞只能產生一種抗體。每一個淋巴細胞只能產生一種抗體。所以傳統的抗體的生產方法及缺陷是什么？所

20、以傳統的抗體的生產方法及缺陷是什么？怎樣解決這個問題？怎樣解決這個問題？單克隆抗體單克隆抗體 由單個由單個B B淋巴細胞經過無性繁殖（克隆），淋巴細胞經過無性繁殖（克隆），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。克隆抗體。 特點：特點：特異性強、靈敏度高特異性強、靈敏度高 如何大量生產單克隆抗體？如何大量生產單克隆抗體？ 利用淋巴細胞產生抗體的功能利用淋巴細胞產生抗體的功能 利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用腫瘤細胞無限增殖的特性 利用細胞融合的技術將利用細胞融合的技術將兩種細

21、胞融合兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞雜交瘤細胞 利用動物細胞培養技術大量培養雜交利用動物細胞培養技術大量培養雜交瘤細胞瘤細胞如何篩選？如何篩選？融融合合方方式？式？ 單克隆抗體制備過程 注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養篩選，繼續培養足夠數量的、能產生特定抗體的細胞群體外培養注射到小鼠腹腔單克隆抗體思考：1 1、本過程利用了哪些原理？、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養原理原理2 2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B B細胞融細胞

22、融合？合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質，不僅具有胞的遺傳物質，不僅具有B B細胞分泌抗體細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體可以獲得大量單克隆抗體單克隆抗體的應用單克隆抗體的應用與常規抗體相比，單克隆抗體產量高，特異性與常規抗體相比，單克隆抗體產量高，特異性強，靈敏度高，優越性十分明顯。強，靈敏度高，優越性十分明顯。應用主要有：應用主要有：1 1、臨床診斷、臨床診斷2 2、作為載體，運載抗癌藥物，形成、作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導彈生物導彈”治療腫治療腫瘤瘤資料

23、：目前世界各國已經研制出數以百計的單克資料：目前世界各國已經研制出數以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作病、血液病、內分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內診斷，借以鑒別和定位體內做體內診斷，借以鑒別和定位體內“病灶病灶”也引起人也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。斷。植物體細胞雜交和動物細胞融合的比植物體細胞雜交和動物細胞

24、融合的比較較比較項目比較項目植物體細胞雜交植物體細胞雜交動物細胞融合動物細胞融合細胞融合原理細胞融合原理細胞膜的流動性、細胞膜的流動性、 細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞融合的方法細胞融合的方法 去除細胞壁后誘導去除細胞壁后誘導原生質體融合原生質體融合使細胞分散后誘使細胞分散后誘導細胞融合導細胞融合誘導方法誘導方法物理（離心、振蕩、物理（離心、振蕩、電刺激）電刺激）化學（聚乙二醇）化學（聚乙二醇）物理、化學方法物理、化學方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒用途用途獲得雜種植株獲得雜種植株制備單克隆抗體制備單克隆抗體 下圖為某同學根據雜交瘤技術的方法，設計的生產破傷風桿菌的實驗方案2、該方案

25、能達到預期效果嗎？為什么？4、圖中B為_過程，常用_作為誘導劑，該細胞繼承_的遺傳特性，既能_,又能_。1、該實驗方案的目的是_3、A是從小鼠的脾臟中取得_,該細胞能夠產生_5、C過程指細胞培養，該過程包括_培養和_培養兩個階段，其中_代以內的的細胞屬于細胞株。制備單克隆抗體B細胞抗體細胞融合滅活病毒雙親細胞分泌抗體無限增殖原代傳代50B體外培養骨髓瘤細胞雜交瘤細胞足夠數量的細胞群注射到小鼠腹腔AC 思考討論：為什么體內細胞沒有表現出思考討論：為什么體內細胞沒有表現出全能性，而是分化成為不同的組織、器官？全能性，而是分化成為不同的組織、器官？ 基因在特定空間和時間條件下基因在特定空間和時間條件下選擇性表達選擇性表達的結果。在個體發育的不同時期，生物體不同的結果。在個體發育的不同時期，生物體不同部位的細胞表達的基因是不同的，合成的蛋白部位的細胞表達的基因是不同的，合成的蛋白質也不一樣，從而形成了不同的組織和器官。質也不一樣，從而形成了不同的組織和器官。植物組織培養關鍵詞：關鍵詞：外植體、脫分化、再分化、愈傷組織外植體、脫分化、再分化、愈傷組織細胞離體、一定的營養物質、細胞離體、一定的營養物質、激素和其他外界條件激素和其他外界條件必要條件：必要條件：（三） 植物體細胞雜交1 1、定義：、定義： 用兩個來自不同植物的體細胞融合成用兩個來自不同植物的體細胞融合成一個雜種