1、布魯氏菌血清學檢驗布魯氏菌血清學檢驗 免疫學基礎免疫學基礎 n由于布魯氏菌培養的營養條件苛刻而且時間長，所以布魯氏菌的血清學診斷越來越受到重視。 主要是根據相應抗原抗體可以在體主要是根據相應抗原抗體可以在體外發生特異性結合并呈現可見反應的外發生特異性結合并呈現可見反應的原理原理,用已知抗原用已知抗原(或抗體或抗體)檢測體液中檢測體液中未知的抗體未知的抗體(或抗原或抗原).由于試驗時通常由于試驗時通常是用患者血清作為待檢材料是用患者血清作為待檢材料,所以檢測所以檢測抗原抗體的體外試驗又稱為血清學試抗原抗體的體外試驗又稱為血清學試驗或血清學反應驗或血清學反應. n血清學檢查既可協助早期診斷，還可血

2、清學檢查既可協助早期診斷，還可確定是否復發或重復感染。確定是否復發或重復感染。n感染感染1-2周后，患者血清中出現周后，患者血清中出現IgM抗抗體，可以用凝集試驗或抗人球蛋白試體，可以用凝集試驗或抗人球蛋白試驗檢測驗檢測n感染周后，患者血清中出現感染周后，患者血清中出現IgG抗體，抗體，可以用補體結合試驗，熒光抗體或可以用補體結合試驗，熒光抗體或ELISA檢測檢測 虎紅平板的凝集反應RBPT） 原理原理n該試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集該試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗。由于所用的抗原是酸性試驗。由于所用的抗原是酸性PH3.63.9帶色的抗原，該抗原帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血

3、清中的與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該項反應的特異性。類，因此提高了該項反應的特異性。 器材與試劑n虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加樣器、混合棒或牙簽 試驗方法n在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，在5分鐘內觀察結果。(四四) 結果判定結果判定n有二種方法，第一種是，出現可見的凝集反應就判為陽性；n另一種用“+”表示凝集程度按下列標準用加號記錄反應強度：n+：出現大的凝聚片或小的粒狀物，液體完全透明，100%凝集n+：

4、有明顯的凝聚片，液體幾乎完全透明，75%凝集n+：有可見的凝集片，液體不甚透明，50%凝集n+：液體混濁，只有少量粒狀物，25%凝集n-：液體均勻混濁評價評價n此法簡便、快速、容易操作，適于基層大面積檢疫；n此法有一定敏感性，檢查牛的陽性率稍高于綿羊、山羊。n因為在酸性環境下IgM活性受抑，該法主要是檢查IgG類凝集抗體，所以特異性較好，與補體結合試驗、二巰基乙醇2-ME試驗和抗球蛋白Coombs0試驗有較高的吻合率。n該法受制備抗原時條件影響較大，所以每批制備抗原應予以檢查、標化方可應用。 試管凝集試驗試管凝集試驗的原理1897年萊特氏等(Wright)與其同事發現患該病的病人血清與馬爾他細

5、菌的培養物產生了凝集現象，遂稱之為萊特氏凝集反應，成了迄今常用的血清學診斷方法之一。設備及試劑n試管凝集抗原n被檢血清n0.5%的石碳酸生理鹽水n吸管n試管n試管架n孵箱操作步驟n被檢血清的稀釋:一般情況下,每份血清用5支小試管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理鹽水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸取被檢血清0.2毫升,加入第一管中,混勻?；靹蚝? 以該吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以該吸管將第三管混勻，并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀釋到第五管,混勻后從第五管吸出0.5毫升棄去.如此稀釋后,從第二管起血清稀釋度分別為1:12.5 1:25 1:5

6、0 1:100操作步驟n加入抗原:先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當稀釋一般是作1:10稀釋）,稀釋后的抗原加入各稀釋的血清管第一管不加，作為血清對照）,每管0.5毫升,混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1毫升，從第二管起血清稀釋度分別為1:25 1:50 1:100 1:200，從第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。n對照管的制作:n抗原對照適當稀釋的抗原加石碳酸鹽水）n被檢血清對照n陰性對照陰性血清稀釋后加抗原）n陽性對照陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）n然后將試驗管和對照管充分混勻后，放于37溫箱中20-22小時后取出，在室溫下放置2個小時，以比濁管為標準判定結果。結果的判定

7、n判定比濁管的制備判定比濁管的制備:每次試驗須配制比濁每次試驗須配制比濁管作為判定的標準依據管作為判定的標準依據.n配制方法是配制方法是:取本次試驗用的抗原稀釋液取本次試驗用的抗原稀釋液一般一般1:105-10毫升，加入等量的毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管表配制比濁管n比濁管的配制比濁管的配制 試管凝集反應標準比濁管配制管號 抗原稀釋液ml） 生理鹽水ml） 透明度 標志1 0.00 1.00 100% + 2 0.25 0.75 75% + 3 0.50 0.50 50% + 4 0.75 0.25 25% 5 1.00 0.

8、00 0% 結果記錄n根據各管中上層液體的清亮程度記錄結果，根據各管中上層液體的清亮程度記錄結果，特別是特別是50%清亮度（清亮度（+）對判定結果關系）對判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定較大，一定要與比濁管對比判定n血清對照為清亮透明無沉淀血清對照為清亮透明無沉淀,抗原對照為均抗原對照為均勻混濁在兩種對照管都成立的情況下，才勻混濁在兩種對照管都成立的情況下，才可判定試驗管，否則應重做。對沉淀需要可判定試驗管，否則應重做。對沉淀需要經驗判定。經驗判定。n “+” 幾乎完全凝集，上清液75%清亮n“+”顯著凝集，上清液50%清亮n“+” 微量凝集，液體25%清亮n “-” 無凝集，液體不清

9、亮n確定每份血清滴度是以出現“+”及以上的凝集現象的最高血清稀釋度n“+”完全凝集，上清液完全凝集，上清液100%清亮清亮診斷標準n沒有進行過菌苗接種的人、畜血清試驗的標準是：n人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：100( +)及以上者為陽性，1：50(+)為可疑。n豬、羊(綿羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(+)及以上者為陽性，1：25(+)為可疑。n對可疑反應的人和動物應在10-25天內重復檢查，以便進一步確定診斷。影響試驗結果的因素及注意事項n 受檢血清應新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10，采血后應于34日內進行檢查，因放置時間過長可能會導致血清效價降低。n 遵守操作

10、規程：所用的器材要清潔、枯燥，試劑的加量一定要正確，放入溫箱的溫度和時間都要按要求，否則都影響結果。每份血清和抗原均要有對照。n高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在1012%，一般切記人血清不能用高滲鹽水。n作凝集反應時，有個別血清會出現前帶現象，即作凝集反應時，有個別血清會出現前帶現象，即稀釋度低的血清管內稀釋度低的血清管內(或血清量多的格或血清量多的格)不發生凝不發生凝集，而稀釋度高的管內集，而稀釋度高的管內(或血清量少的格或血清量少的格)出現凝出現凝集，這叫做前帶現象。如果某血清在平板凝集反集，這叫做前帶現象。如果某血清在平板凝集反應中出現了前帶現象，那么做試管反應時應多做應中出現了前帶現象，

11、那么做試管反應時應多做幾個管，多采用幾個稀釋度。幾個管，多采用幾個稀釋度。n 氯化鈉的含量增高對血清反應有明顯的影響，鹽氯化鈉的含量增高對血清反應有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應的敏感性提高，因此在獸醫界的濃度越高，反應的敏感性提高，因此在獸醫界為了克服凝集反應中的阻抑抗體的干擾，對羊血為了克服凝集反應中的阻抑抗體的干擾，對羊血清采用高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在清采用高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在1012%，切記一般人血清不能用高滲鹽水。，切記一般人血清不能用高滲鹽水。n 前帶現象產生的原因n 膠體粒子學說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結合，而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現凝集。