1、細(xì)胞器的分別、純化細(xì)胞器的分別、純化 細(xì)胞分級分別法細(xì)胞分級分別法秦川實(shí)驗?zāi)康膶?shí)驗?zāi)康膶?shí)驗原理實(shí)驗原理實(shí)驗用品實(shí)驗用品實(shí)驗方法實(shí)驗方法運(yùn)用范圍：運(yùn)用范圍： 1.病毒及亞細(xì)胞病毒及亞細(xì)胞 組份分別組份分別 2.蛋白梯度分別蛋白梯度分別 3.脂蛋白分別脂蛋白分別 4.RNA梯度沉淀梯度沉淀 5.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提純提純 Back 認(rèn)識離心機(jī)及學(xué)習(xí)離心機(jī)的運(yùn)用方法認(rèn)識離心機(jī)及學(xué)習(xí)離心機(jī)的運(yùn)用方法 學(xué)習(xí)細(xì)胞器的分別及純化的普通原理和學(xué)習(xí)細(xì)胞器的分別及純化的普通原理和方法方法實(shí)驗?zāi)康膶?shí)驗?zāi)康腂ack實(shí)驗原理實(shí)驗原理 離心技術(shù)是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離離心技術(shù)是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)穎粒

2、的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮心力，根據(jù)物質(zhì)穎粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分別的分別分析技術(shù)。力等因子的不同，而使物質(zhì)分別的分別分析技術(shù)。 細(xì)胞分級分別式一種經(jīng)過離心從而分別細(xì)細(xì)胞分級分別式一種經(jīng)過離心從而分別細(xì)胞內(nèi)不同構(gòu)呵斥分的細(xì)胞器。不同的細(xì)胞器的大小胞內(nèi)不同構(gòu)呵斥分的細(xì)胞器。不同的細(xì)胞器的大小和密度不同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度不同，用和密度不同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度不同，用差速離心法、密度梯度離心法、密度梯度平衡離心差速離心法、密度梯度離心法、密度梯度平衡離心法分別細(xì)胞器。法分別細(xì)胞器。 差速離心法是從低到高不同的轉(zhuǎn)速離心，差速離心法是從低到高不同的轉(zhuǎn)速離心，使

3、較大的顆粒先在低轉(zhuǎn)速中沉淀，再用較高轉(zhuǎn)速將使較大的顆粒先在低轉(zhuǎn)速中沉淀，再用較高轉(zhuǎn)速將原來懸浮的小顆粒物質(zhì)沉淀下來，從而到達(dá)逐級分原來懸浮的小顆粒物質(zhì)沉淀下來，從而到達(dá)逐級分別。別。相對離心力RCF由于轉(zhuǎn)頭有不同的制造商制造，半徑不同，故用相對離心力來表示離心力的大小。RCF (g) = Fc/F重力 = mG/mg = r2/g = 1.11910-5N2r =11.2r(N/1000)2也有：根據(jù)這個公式，相對離心力RCF和每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)N之間便可以互換，這種互換關(guān)系是很有適用價值的。Back為了簡便為了簡便實(shí)驗用品實(shí)驗用品資料：新穎菠菜資料：新穎菠菜器材：器材： 顯微鏡、高速低溫離心機(jī)、普通

4、離心顯微鏡、高速低溫離心機(jī)、普通離心機(jī)、離心管、機(jī)、離心管、200目的尼龍網(wǎng)、漏斗、燒杯、組織目的尼龍網(wǎng)、漏斗、燒杯、組織研磨器。研磨器。試劑：試劑： 線粒體離心勻漿介質(zhì)。線粒體離心勻漿介質(zhì)。 1%詹納斯綠詹納斯綠B的的0.25M蔗糖溶液。蔗糖溶液。 0.05M Tris-HCl液體液體 Ph=8.0 0.35mol/L NaCl Back勻漿介質(zhì)，普通為一定濃度的蔗糖溶液參與其它勻漿介質(zhì)，普通為一定濃度的蔗糖溶液參與其它離子成分，可以維持亞細(xì)胞組分的浸透壓。離子成分，可以維持亞細(xì)胞組分的浸透壓。臺式高、超臺式高、超速離心機(jī)速離心機(jī)0.6-10萬萬rpm離心機(jī)離心機(jī)制備性制備性分析性分析性分析

5、性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺式或臺式或地面式地面式普通離心普通離心機(jī)機(jī)大容量冰大容量冰凍離心機(jī)凍離心機(jī)小于小于0.6萬萬rpm高速冰凍高速冰凍離心機(jī)離心機(jī)0.6-2.5萬萬超速冰凍超速冰凍離心機(jī)離心機(jī)2.5-8萬或萬或更高更高( (分析性超速離心主要用于檢測大分析性超速離心主要用于檢測大分子物質(zhì)的沉降特征和構(gòu)造等分子物質(zhì)的沉降特征和構(gòu)造等) )概述概述Back ！ 離心機(jī)普通由離心機(jī)主機(jī)，轉(zhuǎn)頭，離心管三部分組成。離心機(jī)普通由離心機(jī)主機(jī)，轉(zhuǎn)頭，離心管三部分組成。離心機(jī)普通由離心機(jī)主機(jī)，轉(zhuǎn)頭，離心管三部分組成。Back普通制備離心普通制備離心 普通制備離心

6、是指在分別、濃縮、提純樣品中，普通制備離心是指在分別、濃縮、提純樣品中，不用制備密度梯度的一次完成的離心操作，實(shí)驗室用不用制備密度梯度的一次完成的離心操作，實(shí)驗室用低、高速離心機(jī)可運(yùn)用于此項技術(shù)。低、高速離心機(jī)可運(yùn)用于此項技術(shù)。臺式或地面式普通離心機(jī)臺式或地面式普通離心機(jī)Back高速冰凍離心機(jī)高速冰凍離心機(jī)Back 從低速到高速逐級沉淀分別，使較大的顆粒先在較低轉(zhuǎn)速從低速到高速逐級沉淀分別，使較大的顆粒先在較低轉(zhuǎn)速中沉淀，再用較高轉(zhuǎn)速將原先懸浮在上清液中的較小顆粒分別中沉淀，再用較高轉(zhuǎn)速將原先懸浮在上清液中的較小顆粒分別沉淀下來，從而使各種亞細(xì)胞組分得以分別。沉淀下來，從而使各種亞細(xì)胞組分得以

7、分別。 差速離心法主要用于分別細(xì)胞器和病毒。差速離心法主要用于分別細(xì)胞器和病毒。其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開，其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清夜與沉淀分開，并可運(yùn)用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。并可運(yùn)用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺陷是：分別效果差，不能一次得到純顆粒；壁效應(yīng)嚴(yán)重，缺陷是：分別效果差，不能一次得到純顆粒；壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側(cè)會出現(xiàn)沉淀；顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。集而失活。細(xì)胞器沉降順

8、序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、核蛋白體。差速離心法：差速離心法：Low speedHigh speed差數(shù)離心法差數(shù)離心法Back密度梯度離心法：密度梯度離心法： 器具有梯度的介質(zhì)來交換離心管中密度均一器具有梯度的介質(zhì)來交換離心管中密度均一的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不同的層次，濃度低的在上的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不同的層次，濃度低的在上層，高的在底層。細(xì)胞勻漿加在最上層，隨后離層，高的在底層。細(xì)胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，不同大小、形狀、密度的顆粒，就會心。這樣，不同大小、形狀、密度的顆粒，就會以不同的速度向下挪動，擊中到不同的區(qū)域，可以不同的速度向下挪動，擊中到不同的區(qū)

9、域，可以分別搜集。以分別搜集。該法的優(yōu)點(diǎn)是：分別效果好，可一次獲得較純該法的優(yōu)點(diǎn)是：分別效果好，可一次獲得較純顆粒；順應(yīng)范圍廣，既能分別具有沉淀系數(shù)差顆粒；順應(yīng)范圍廣，既能分別具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分別有一定浮力密度的顆粒；顆的顆粒，又能分別有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會積壓變形，能堅持顆粒活性，并防止已構(gòu)粒不會積壓變形，能堅持顆粒活性，并防止已構(gòu)成的區(qū)帶由于對流而引起混合。成的區(qū)帶由于對流而引起混合。缺陷：缺陷： 離心時間較長；需求制備梯度；操離心時間較長；需求制備梯度；操作嚴(yán)厲，不宜掌握。作嚴(yán)厲，不宜掌握。 Back 將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換算為將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換算為相對離心力時，相對離心力時，首先

10、，在首先，在 r r標(biāo)尺上取知標(biāo)尺上取知的半徑和在的半徑和在 N N 標(biāo)尺上取標(biāo)尺上取知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)。知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)。然后，將這兩點(diǎn)間劃一然后，將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間條直線，在圖中間 RCF RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對離心力數(shù)值。應(yīng)的相對離心力數(shù)值。留意，假設(shè)知的轉(zhuǎn)數(shù)值留意，假設(shè)知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于處于 N N 標(biāo)尺的右邊，那標(biāo)尺的右邊，那么應(yīng)讀取么應(yīng)讀取 RCF RCF 標(biāo)尺右邊標(biāo)尺右邊的數(shù)值；同樣，轉(zhuǎn)數(shù)值的數(shù)值；同樣，轉(zhuǎn)數(shù)值處于處于 N N 標(biāo)尺左邊，那么標(biāo)尺左邊，那么讀取讀取 RCF RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)標(biāo)尺左邊的數(shù)值。值。半徑半徑相對離心力相對離心力轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速

11、方法：方法：兩點(diǎn)一兩點(diǎn)一線法線法Back應(yīng)急處置：應(yīng)急處置： 假設(shè)離心時發(fā)現(xiàn)離心管破裂，必需先停頓實(shí)驗，將破假設(shè)離心時發(fā)現(xiàn)離心管破裂，必需先停頓實(shí)驗，將破裂管密封放入生物渣滓桶，再用裂管密封放入生物渣滓桶，再用75%酒精進(jìn)展擦拭消毒，如必酒精進(jìn)展擦拭消毒，如必要需用挪動紫外燈照射要需用挪動紫外燈照射3060分鐘后才干開場實(shí)驗。分鐘后才干開場實(shí)驗。本卷須知：本卷須知：a離心機(jī)應(yīng)一直處于程度位置，與外接電源電壓匹配，并要求離心機(jī)應(yīng)一直處于程度位置，與外接電源電壓匹配，并要求有良好的接地線。有良好的接地線。b開機(jī)前應(yīng)檢查機(jī)腔有無異物掉入。本卷須知：開機(jī)前應(yīng)檢查機(jī)腔有無異物掉入。本卷須知：c樣品應(yīng)預(yù)先

12、平衡，運(yùn)用離心機(jī)微量離心時離心套管與樣品應(yīng)樣品應(yīng)預(yù)先平衡，運(yùn)用離心機(jī)微量離心時離心套管與樣品應(yīng)同時平衡。同時平衡。d揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應(yīng)運(yùn)用帶蓋的離心管，并確保揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應(yīng)運(yùn)用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免侵蝕機(jī)腔或呵斥事故。液體不外漏以免侵蝕機(jī)腔或呵斥事故。e每次操作終了，應(yīng)做好運(yùn)用情況記錄，應(yīng)定期對機(jī)器各項性每次操作終了，應(yīng)做好運(yùn)用情況記錄，應(yīng)定期對機(jī)器各項性能進(jìn)展檢修。能進(jìn)展檢修。f離心過程中假設(shè)發(fā)現(xiàn)異常景象，應(yīng)立刻封鎖電源，報請有關(guān)離心過程中假設(shè)發(fā)現(xiàn)異常景象，應(yīng)立刻封鎖電源，報請有關(guān)技術(shù)人員檢修。技術(shù)人員檢修。Back玉米黃化幼苗線粒體的分別整個過程堅持在玉

13、米黃化幼苗線粒體的分別整個過程堅持在0-41.將玉米黃化幼苗剪下，稱重每小組約將玉米黃化幼苗剪下，稱重每小組約5g，在冰箱，在冰箱中放置中放置1小時小時2.將幼苗剪碎直接倒入研缽中以將幼苗剪碎直接倒入研缽中以1:3(分量體積比分量體積比g:ml)比例參與離心勻漿介質(zhì)，快速研磨，留意先比例參與離心勻漿介質(zhì)，快速研磨，留意先參與少許介質(zhì)液，研碎后將余液參與參與少許介質(zhì)液，研碎后將余液參與3.用雙層尼龍網(wǎng)過濾，除去殘渣。用雙層尼龍網(wǎng)過濾，除去殘渣。4.取濾液在低溫高速離心機(jī)傷取濾液在低溫高速離心機(jī)傷2300rpm離心離心10min棄沉淀棄沉淀5.取上清液在低溫高速離心機(jī)上取上清液在低溫高速離心機(jī)上9

14、950rpm離心離心10min棄上清液棄上清液6.所留沉淀用勻漿介質(zhì)液洗滌，以所留沉淀用勻漿介質(zhì)液洗滌，以9950rpm離心離心10min棄上清棄上清7.將所得沉淀懸浮于將所得沉淀懸浮于0.5M，ph=7.2甘露醇中，至甘露醇中，至于冰箱備用。于冰箱備用。8.將制備的線粒體懸液滴于干凈的載玻片上用將制備的線粒體懸液滴于干凈的載玻片上用1%詹詹納斯綠納斯綠B的的0.25M蔗糖液蔗糖液ph=7.4染色染色20min9.加干凈的蓋玻片。鏡檢最好用相差顯微鏡，一切加干凈的蓋玻片。鏡檢最好用相差顯微鏡，一切的線粒體都被染成藍(lán)綠色顆粒，檢驗制備的線粒的線粒體都被染成藍(lán)綠色顆粒，檢驗制備的線粒體的純度體的純度實(shí)驗方法實(shí)驗方法菠菜葉葉綠體的分別整個過程堅持菠菜葉葉綠體的分別整個過程堅持0 1取去葉脈的的新穎菠菜葉取去葉脈的的新穎菠菜葉5g于研缽中，參與于研缽中，參與0.35mol/L NaCl溶液溶液15ml研磨。留意開場研磨時也是先參與少許介研磨。留意開場研磨時也是先參與少許介質(zhì)，研磨后參與余液質(zhì)，研磨后參與余液2綠色的勻漿液用尼龍網(wǎng)過濾，濾液分別轉(zhuǎn)入兩支干凈的離綠色的勻漿液用尼龍