1、-實驗三微生物的接種、別離純化與培養方法實驗目的：學習掌握無菌操作技術；學習接種方法；學習常用的別離、純化菌種的方法。實驗容：一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養基上或活的生物體的過程叫做接種。、接種工具和方法在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進展液體接種。在固體培養基外表要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。圖圖接種和別離工具1接種針 2.接種環 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：劃線接種 這是最常

2、用的接種方法。即在固體培養基外表作來回直線形的移動，就可到達接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點接種 在研究霉菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板外表上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進展接種的。穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如*細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培

3、養皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就到達稀釋的目的。待平板凝固之后，置適宜溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。液體接種 從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱為液體接種。注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接

4、入人體，來預防*些疾病。活體接種 活體接種是專門用于培養病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是*個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養。、無菌操作培養基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具如接種針和吸管等在無菌條件下接種含菌材料如樣品、菌苔或菌懸液等于培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。實驗臺面不管是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養基時利于培養皿平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應盡量減少，其

5、周圍雜菌也應越少越好。為此，必須清掃室，關閉實驗室的門窗，并用消毒劑進展空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數量?？諝庵械碾s菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時，翻開培養皿的時間應盡量短。用于接種的器具必須經干熱或火焰等滅菌。接種環的火焰滅菌方法：通常接種環在火焰上充分燒紅接種柄，一邊轉動一邊慢慢地來回通過火焰三次，冷卻，先接觸一下培養基，待接種環冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養基上。圖然后，將接種環從柄部至環端逐漸通過火焰滅菌，復原。不要直接燒環，以免殘留在接種環上的菌體爆濺而污染空間。平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養皿的蓋翻開一小局部進展接種。在向

6、培養皿倒培養基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應傾斜一下在火焰上通過。圖斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、別離純化含有一種以上的微生物培養物稱為混和培養物Mi*ed culture。如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，則這個菌落稱為純培養Pure culture。在進展菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為別離純化，方法有許多種。、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在4050°左右的營養瓊脂培養基充分混合，然

7、后把這混合液傾注到無菌的培養皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經過屢次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物。圖，a圖傾注平板法a涂布平板法b圖解1.菌懸液 2.熔化的培養基 3.培養物 4.無菌水、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當的稀釋，取一定量的稀釋液放在無菌的已經凝固的營養瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基外表上，經恒溫培養便可以得到單個菌落。圖，b、平板劃線法最簡單的別離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環取培養物少許在平板上進展劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法

8、、方格法、放射法、四格法等。圖當接種環在培養基外表上往后移動時，接種環上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經培養，每一個細胞長成一個菌落。圖、富集培養法富集培養法的方法和原理非常簡單。我們可以創造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進展競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。所創造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在一樣的培養基和培養條件下，經過屢次重復移種，最后富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。如果要別離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過屢次重復移種便可以

9、得到純的寄生菌。圖平板劃線別離法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法、厭氧法在實驗室中，為了別離*些厭氧菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進展接種。接種后，參加無菌的石蠟于培養基外表，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO2取代培養基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地別離*些厭氧菌，可以把所別離的樣品接種于培養基上，然后再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。三、培養微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養物濃度、

10、溫度、水分、氧氣、等。微生物的種類不同，培養的方式和條件也不盡一樣。、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1)營養物濃度細菌的生長率與營養物的濃度有關:=ma*C/(K+C) 營養物濃度與生長率的關系曲線是典型的雙曲線。K值是細菌生長的很根本的特性常數。它的數值很小，說明細菌所需要的營養濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營養太低時，細菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生長需要能量以外，細菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養物濃度的增加，生長率愈接近

11、最大值。溫度在一定的溫度圍，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物也要停頓生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常受其它環境條件的影響而發生變化。根據微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數在-1020之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在2045之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45以上。

12、水分水分是微生物進展生長的必要條件。芽孢、孢子萌發，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發育的水分活性圍，均具有狹小的適當的水分活性區域。氧氣按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數微生物都屬于這個類型。b.兼性需氧微生物這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進展的代途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進展發酵

13、作用，例如酵母菌的無氧乙醇發酵。c.微量需氧微生物這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。c.厭氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產生毒害，不是被抑制，就是被殺死。、培養方法1根據培養時是否需要氧氣，可分為好氧培養和厭氧培養兩大類。好氧培養：也稱“好氣培養。就是說這種微生物在培養時，需要有氧氣參加，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。厭氧培養：也稱“厭氣培養。這類微生物在培養時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過程中，最重要的一點就是要除去培養基中的氧氣。一般可采用以下幾種方法：a.降低培養基中的氧化復原電位：常將復原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，參加到培養基中，便可到達目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦參加到培養基中，也可適合厭氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養吸收氧氣；用植物組織如發芽的種子吸收氧氣；用產生氫氣與氧化合