1、水處理生物學實驗講義凌 琪 陶 勇2017年3月水處理生物學實驗目錄及實驗報告書寫順序書寫順序實驗名稱書寫要求實驗一顯微鏡的使用及微生物形態的觀察1、按“書寫順序”寫2、實驗報告不要缺項3、盡量參考實驗講義4、須詳細說明自己的實驗結果5、須完成思考題實驗二微型動物的計數實驗三大腸桿菌生長曲線的測定實驗四細菌、霉菌、酵母菌、放線菌形態的觀察實驗五培養基的制備及滅菌實驗六細菌的革蘭氏染色實驗七微生物純種分離、培養及接種技術實驗八純培養菌種的菌體、菌落形態觀察實驗九微生物的生理生化特性實驗一 顯微鏡的使用及微生物形態的觀察一、目的1學習普通光學顯微鏡的使用方法（本實驗學習低倍鏡和高倍鏡的使用）。2通

2、過對教學生物標本玻片或曝氣池活性污泥的觀察，認識微生物的形態。二、實驗器材1教學生物標本玻片或曝氣池活性污泥。2顯微鏡、目測微尺、物測微尺、載玻片、蓋玻片等。三、實驗步驟(一)顯微鏡的結構和各部分的作用圖81所示，是微生物檢驗常用的顯微鏡，其構造分機械和光學兩部分。機械部分主要包括：1鏡筒 鏡筒長度一般是160mm。它的上端裝有接目鏡，下端有回轉板。回轉板上一般裝有3個接物鏡。2載物臺 載物臺是放置標本的平臺，中央有一圓孔。使下面的光線可以通過。兩旁有彈簧夾，用以固定標本或載玻片。有的載物臺上裝有自動推物器。3調節器 鏡筒內旁有兩個螺旋，大的叫粗調節器，小的叫細調節器，用以升降鏡筒。調節接物鏡

3、與所需觀察的物體之間的距離。光學部分主要包括：1 接目鏡 一般使用的顯微鏡具有23個接目鏡，其上常刻有“5×”、“l0×”或“15×”等數字及符號，意即使用時可放大5倍、l0倍或15倍。觀察微生物時常用放大l0倍或15倍的接目鏡。2接物鏡 接物鏡裝在回轉板上可分低倍鏡、高倍鏡和油鏡3種，其相應的放大倍數常是10、40(或45)l00(或90)。通常顯微鏡的放大倍數等于接物鏡與接目鏡放大倍數的乘積。例如，用放大40倍的接物鏡(高倍鏡)與放大10倍的接目鏡時所得的物象的放大倍數為40×10400，如果用放大15倍的接目鏡則放大倍數為40×15600

4、。接目鏡裝在鏡筒上端，在使用過程中并不經常變動，所以通常所謂的低倍鏡、高倍鏡或油鏡的觀察主要是指使用不同的接物鏡而言的。油鏡的放大倍數最大(90或100)。放大倍數這樣大的鏡頭，焦距就很短，直徑就很小，所以自標本玻片透過的光線，因介質密度(從玻片至空氣，再進入油鏡)不同，有些光線因折射或全反射，就不能進入境頭，致使射入的光線較少，物象顯現不清。所以為了不使通過的光線有所損失，須在油鏡與玻片中間加入和玻璃折射率（n=1.52）相仿的鏡油(香柏油， n=1.515)。因為這種接物鏡使用時須加鏡油，所以我們稱它為油鏡(圖82)。一般的低倍鏡或高倍鏡使用時不加油，所以也稱干鏡。使用低倍鏡和高倍鏡時，一

5、般作活體的觀察，不進行染色。在觀察細小動物時，低倍鏡主要用來區別動物的種類和看出它們的活動狀態，而高倍鏡則可看清動物的結構待征，低倍鏡容易看到標本的全貌，油鏡在大多數情況下是用來觀察染色的涂片。3集光器 集光器在載物臺的下面，用來集合由反光鏡反射來的光線。集光器可以上下調整，中央裝有光圈，用以調節光線的強弱。當光線過強時，應縮小光圈或把集光器向下移動。4反光鏡 反光鏡裝在顯微鏡的最下方至集光器。(二)顯微鏡使用和保護的方法1低倍鏡的使用法(1)置顯微鏡于固定的桌幾上，窗外不宜有障礙視線之物。(2)撥動回轉板，把低倍鏡移到鏡筒正下方，和鏡筒連接而對直。(3)撥動反光鏡向著光線的來源處。同時用眼對

6、準接目鏡(選用適當放大倍數的接目鏡)仔細觀察，使視野完全成為白色，這是光線已經通到鏡里的表示。(4)把載玻片放到載物臺上，要觀察的標本放到圓孔的正中央。(5)將粗調節器向下旋轉，同時眼睛注視接物鏡，以防接物鏡和載玻片相碰。當接目鏡的尖端距載玻片約0.5cm時停止旋轉。(6)把粗調節器向上旋轉，同時左眼向接目鏡里觀察。如標本顯出，但不十分清楚，可用細調節器調節，至標本完全清晰為止。(7)假如因旋轉粗調節器太快，致使超過焦點，標本不能出現時，不應在眼睛注視接目鏡的同時向下旋轉粗調節器，必須從第(5)步做起，以防因沒有把握的旋轉，使接目鏡與載玻片碰觸。(8)在觀察時，最好兩眼都能同時睜開一面看一面畫

7、出所看到的物象。2高倍鏡的使用法(1)使用高倍鏡以前，先用低倍鏡檢查，把要觀察的標本放到視野正中。(2)撥動回轉板使高倍和低倍兩鏡頭互相對換。當高倍鏡移動到載玻片時，往往鏡頭十分靠近載玻片。這時必須注意是否因高倍鏡靠近的緣故而使載玻片也隨著移動。如果載玻片有移動的現象，則應立刻停止推動回轉板，把高倍鏡退回原處，再按照使用低倍鏡的方法，校正標本的位置，然后旋動調節器，使鏡筒稍微向上，再對換高倍鏡頭。(3)當高倍鏡已被推到鏡筒下面時，向鏡內觀察所顯現的標本，往往不很清楚，這時可旋轉細調節器，上下移動，但不要過分移動。3油鏡的使用法(此節在實驗三中學習)(1)如用高倍鏡放大，倍數還不夠，則須采用油鏡

8、。用油鏡以前，先用高倍鏡檢查，把要觀察的標本放到視野正中。(2)用油鏡時，在載玻片上加一滴鏡油，然后撥動回轉板對換高倍鏡和油鏡，使油鏡頭尖端和油接觸，而后向接目鏡觀察。假如不清晰，可稍微轉動調節器，但切記不要用粗調節器。(3)用過油鏡后，必須用擦鏡紙或軟綢將載玻片和油鏡所粘著的油拭凈。必要時，可略蘸二甲苯少許，揩拭鏡頭，最后用擦鏡紙或軟綢擦干。4顯微鏡的保護法(1)顯微鏡應放置在干燥的地方，使用時須避免強烈的日光照射。(2)接物鏡或接目鏡不清潔時，應當用擦鏡紙或軟綢揩擦。(3)用完顯微鏡后，應當立即放到鏡匣中。(三)顯微鏡觀察(1)低倍鏡觀察1)在選定的接目鏡下，利用低倍鏡，確定目測微尺一格的

9、長度(單位以µm計)。2)觀察教學生物標本玻片或所制備的微生物標本玻片，畫出所見的形態草圖。3)記下觀察所用接目鏡和接物鏡的放大倍數和算出顯微鏡的放大倍數。(2)高倍鏡觀察1)改用高倍鏡觀察，畫出微生物的形態草圖，并與用低倍鏡所看到的比較，注意其不同點。2)記下顯微鏡的放大倍數。四、記錄序 號玻片名稱放大倍數形態草圖五、思考題1使用顯微鏡時，哪些地方須特別注意?2使用低倍鎊時，顯微鏡的放大倍數一般最大可達多少?使用高倍鏡時顯微鏡的放大倍數是怎樣呢?在什么時候才需要使用油鏡?實驗二 微型動物的計數一、目的顯微鏡觀察活性污泥樣品中微型動物的種類、數量及狀態。二、實驗器材1活性污泥法曝氣池

10、混合液。2顯微鏡、小量筒、滴管等。3計數板 如果沒有微型動物計數的計數板(微型動物，即使是原生動物，也比細菌大得多，般的細菌或血球計數板都不適用)，則可按照上海織襪四廠和上海師范大學生物系所介紹的微型動物計數板制作方法制備如下：采用厚質玻璃割成9cm長，4cm寬的長方塊，玻璃厚度以0.3一0.4cm為宜。利用氫氟酸腐蝕法，使玻板中央刻上10×l0100個小方格，小方格的大小沒有嚴格規定，只要一片大號蓋玻片能蓋滿格子有余和便于在顯微鏡下計數就可以了。用大號蓋玻片切成寬約0.7cm的玻條，用阿拉伯樹膠粘在計數用的小方格的四周，使呈一圈凸起的邊框。這樣，就制成了一塊微型動物計數板，如圖85

11、所示。關于氫氟酸腐蝕法劃方格的方法是先將玻璃表面涂一層薄面均勻的石蠟，然后用尖針在石蠟層上刻出所要求的方格，再以氫氟酸蒸汽進行重蒸。 三、計數方法及步驟 1將活性污泥法曝氣池混合液輕輕攪拌均勻；如混合液較濃，則可稀釋成1：1的液體(稀釋方法：取l0mL量筒一個，加混合液5mL再加蒸餾水5mL，輕輕攪拌均勻，即成1：1稀釋液)。 2取洗凈的滴管一支(滴管每滴水的體積應預先標定，一般每一滴水的體積約為l20mL)，吸取搖勻的混合液或己稀釋的混合液加一滴到計數板的中央方格內，然后加上一塊潔凈的大號蓋玻片，使玻片的四周正好擱在計數板四周凸起的邊框上，側視如圖86所示。3用低倍顯微鏡進行計數 注意所滴加

12、的液體不一定布滿整個l00格小方格，在顯微鏡下計數時只要把充有液體的小方格，挨著次序一行行的計算即可。同時記錄各種動物的活動能力、形態結構等。原生動物中有不少種類是群體，須將群體和群體上的個體分別計數。4計算 設在一滴水中測得鐘蟲30只，則每mL混合液中含有鐘蟲30×2×201200只，如測得輪蟲10只，則每毫升混合液含輪蟲10×2×20400只(如滴管每一摘體積為120mL，所觀察的液體是1：l稀釋的曝氣池混合液)。四、記錄微型動物優勢種（數量及狀態）描述：其他種（種類、數量及狀態）描述：注：(1)如無計數板，則可用下法進行計數：1)取洗凈的滴管1支（

13、其每一滴水的體積應預先標定）吸取混合均勻的曝氣池混合液或已稀釋的混合液，滴1滴在載玻片的中央，以蓋玻片（以方形為好）輕輕蓋上水滴，要避免蓋玻片內形成氣泡。2)將際本放在顯微鏡低倍鏡下計數。計數時，先將視野放在蓋玻片的右上角(可根據各人的習慣，也可放在另一用)，然后移動玻片，視野即可隨之從上而下、從左而右通過。當前一個視野數完，并做好記錄后，再換第二個視野，如此住復將整個蓋玻片下面的動物全部計數完畢。注意在調換視野時，不可使相邦的視野重疊或遺漏。然后換算成1mL混合液中的動物數。3)生物濾池和生物轉盤上的生物膜形成膠狀，濃度大，一般都必須稀釋后計數，其適當的稀釋比可在實踐中摸索。4)上述計數方法

14、僅適用于原生動物和輪蟲，對個體較大的微型動物和線蟲等，則須加大計數容量，以免造成誤差。(2)為了避免微生物游動而影響計數，可用接種環加一環氯化汞（HgCl2）飽和溶液以殺死微生物。五、思考題怎樣通過了解微型動物種類或數量變化來反映廢水處理情況？實驗三 大腸桿菌生長曲線的測定一、實驗器材1培養基及大腸菌液(1)營養瓊脂斜面培養基 可根據實驗五中的配方，配置營養瓊脂培養基后，再制成斜面。(2)肉膏蛋白胨液體培養基 配制方法同實驗五中營養瓊脂培養基，但不加瓊脂。(3)濃肉膏蛋白胨液體培養基 配制方法同肉膏蛋白胨液體培養基，但濃度高5倍。(4)大腸桿菌培養液 將大腸桿菌接種于營養瓊脂斜面培養基上，在3

15、7下培養18小時后，用無菌水加在斜面上，將菌洗下，作成一定濃度的細菌懸液，直接供實驗接種用。或吸取0.3mL細菌懸液，接種到裝有20mL肉膏蛋白胨液體培養基的大試管(20×220mm)內，在37下，振蕩培養18h。2吸管、燒杯等。3光電比色計、高壓蒸汽滅菌器、電冰箱、振蕩器或搖床等。二、實驗內容1實驗處理 以一定濃度的細菌懸液，分別等量地接種在12支液體培養基中，在培養后隔不同時間取出，放入冰箱保存。最后，用比濁法測定菌體生長情況。測量微生物生長的方法有多種。活菌數可用平板計數(菌落計數)法或稀釋計數法。總菌數(包括活菌和死菌的個數)可在顯微鏡下直接計數而求得，由于細菌懸液的濃度與其

16、渾濁度成正比，因此也可利用光電比色計測定細菌懸液的光密度，從而推知菌液的濃度，本實驗就是利用光電比色計進行量測（用平板計數法或稀釋計數法可測出活菌數，從而得出不包括死菌的生長曲線。若教學時間和設備條件容許，宜采用平板計數法或稀釋計數法）。為闡明生長曲線形成的原因，做3個實驗處理：（1）正常生長曲線；（2）追加營養液處理；（3）加酸處理。 2實驗步驟(1)接種 取12支裝有滅菌過的肉膏蛋白胨液體培養基試管(每管裝20mL培養基)，貼上標簽(注明菌名、培養時間等)。然后，用1支1mL無菌吸管，每次準確地吸取0.2mL培養18h的大腸桿菌培養液，接種到肉膏蛋白胨液體培養基內。接種后，輕輕搖蕩，使菌體

17、均勻分布。(2)培養 將接種后的12支液體培養基，置于振蕩器或搖床上。37振蕩培養。其中9支，分別在培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h后取出，放冰箱中儲存，最后一起比濁測定。 酸處理的1支試管，在培養4h后取出，加1mL無菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸3：1：1的體積比），然后繼續振蕩培養，在培養14h后取出，放入冰箱貯存。最后一起比濁測定。追加營養的兩支試管，在培養6h后取出，各加入無菌濃肉膏蛋白胨液體培養基1mL，然后繼續振蕩培養，在培養8、14h后取出，放入冰箱貯存，最后一起比濁測定。(3) 比色、過比濁 把培養不同時間而形成不同濃度的細菌培養液，置于分光光度計中進行比色。用

18、光密度值的大小來代表細菌的生長量。以未接種的肉膏蛋白胨液體培養基為空白對照，在600 nm波長下測菌懸液的光密度值(OD600)。菌懸液的濃度與光密度值成正比，光密度值大者可以認為其生長情況較好。從最稀濃度的細菌懸液開始，依次測定。細菌懸液如果太濃，應適當稀釋，使光密度降至0.00.4范圍內。液體的渾濁度也可用濁度計測定。三、記錄及報告要求1記錄培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h之后細菌懸液的光密度值，以及4h加酸和6h追加營養液后，這三管菌液在所要求的培養時間時的光密度值。2以細菌懸液光密度為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪出大腸桿菌正常、加酸和追加營養的3條生長曲線，并加以比較

19、，標出正常生長曲線中對數期的大致位置，說明曲線變化原因。四、思考題1常用的測定做生物生長的方法有哪幾種?試略加討論。2利用渾濁度所表示的細菌生長量是否包括死細菌?3你認為活性污泥的增長曲線應怎樣測定才比較合適?實驗四 細菌、霉菌、酵母菌、放線菌形態的觀察一、目的1進一步掌握顯微鏡的使用方法。2觀察幾個典型細菌的形態(示范片)。3觀察幾個典型細菌的構造(示范片)。4觀察霉菌、酵母菌、放線菌的形態和構造，以便找出它們之間及與細菌之間的區別點。二、實驗器材1顯微鏡、擦鏡紙、鏡油（香柏油）、二甲苯等。2示范片(1)金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、四聯球菌、尿八聯球菌、鏈球菌、球衣細菌、大腸桿菌、霍亂弧菌等

20、。(2)枯草桿菌芽孢、假單胞桿菌鞭毛、固氮菌莢膜等。(3)酵母菌、霉菌、放線菌。三、實驗內容和方法 1復習顯微鏡的使用方法，重點放在油鏡的使用部分。 2嚴格按照顯微鏡的使用方法，依次逐個觀察細菌的形態、構造及酵母菌、霉菌、放線菌的形態。分別繪出其形態、構造圖。四、記錄（細菌、霉菌、酵母菌、放線菌各一）序 號玻片名稱放大倍數形態草圖實驗五 培養基的制備及滅菌 本次實驗可為下次實驗作準備。實驗內容主要包括玻璃器皿的洗刷、包裝和培養基的制備以及滅菌技術等。在進行微生物學實驗時，所用培養基及玻璃器皿等均須進行滅菌。一、目的1學會玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準備工作。2掌握培養基配制和無菌水制備的方法。3學

21、會高壓蒸汽滅菌技術。二、實驗器材1培養皿(又稱平皿，直徑90mm)、試管、吸管、錐形瓶、燒杯等。2紗布、棉花、報紙、牛皮紙。3pH試紙68.4(或pH電位計或氫離子濃度比色計)、洗液、10HCL、10NaOH。4牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水。5高壓蒸氣滅菌器、烘箱、冰箱、電爐等。三、實驗內容(一)玻璃器皿的洗刷與包裝1洗刷 玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。培養皿、試管、錐形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自來水沖洗。吸管則先用洗液浸泡、再用水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿應放在烘箱中烘干。2包裝(1)培養皿由一底一蓋組成一套，按實驗所需的套數一起用牛皮紙包裝。(2)吸管應在吸端用鐵絲塞入少許

22、棉花，構成1一1.5cm長的棉塞，以防止細菌吸入口中，并避免將口中細菌吹入管內。棉花要塞得松緊適宜，吸時既能通氣，又不致使棉花滑入管內。將塞好棉花的吸管的尖端，放在45cm寬的長紙條的一端，吸管與紙條約成45°交角，折疊包裝紙包住尖端(圖88)，用左手將吸管壓緊，在桌面上向前搓轉，紙條即螺旋式地包在管子外面，余下紙頭折疊打結，按照實驗需要，可單支包裝或多支包裝，以備滅菌。培養皿和吸管也有放在特制容器內進行滅菌的。(3)試管和錐形瓶等的管口或瓶口均需用棉花塞堵塞。做好的棉塞，四周應緊貼管壁和瓶口，不留縫隙，以防空氣中微生物會沿棉塞皺折浸入。棉塞不宜過松或過緊，以手提棉塞，管、瓶不掉下為

23、準。棉塞的23應在管內或瓶口內，上端露出少許，以便拔塞。棉塞的大小及形狀應如圖89所示。在制作培養基的過程中，如不慎將棉塞沾上培養基時，應用清潔棉花重做。待滅菌的試管和瓶子的口都要用牛皮紙包裹，并用線繩捆扎后存放在鐵絲簍內（用紙包裹是為了避免滅菌時冷凝水淋濕棉塞)，以備滅菌。(二)培養基的制備1步驟(1)配制溶液 按培養基的配方，稱取各種原料。取適量的燒杯盛所需水量，依次將各種原料加入、溶解。難溶的原料如蛋白陳、肉膏、瓊脂等需加熱溶解，這時，當原料全部溶解后應加水補充因蒸發損失的水量。加熱時應不斷攪拌以防原料在杯底燒焦。(2)調整pH值 用pH試紙(或pH電位計或氫離子濃度比色計)測定培養基溶

24、液的pH值。(3)過濾 用沙布、濾紙或棉花過濾均可。如培養基內雜質很少，可省略過濾。(4)分裝 將培養基分裝在試管和錐形瓶內。要使培養基直接流入管內或瓶內，注意防止沾污上段管壁或瓶壁，并避免浸濕棉塞。裝入試管或錐形瓶的培養基量，視試管或瓶子的大小及需要而定。一般制備斜面培養基時，每支試管裝入的量約為試管高度的1413。(5)斜面培養基的制作 將裝含有瓊脂的培養基的試管經滅菌后，趁熱擱置在木條或木棒上，使試管呈適當的斜度(切勿傾斜過小，以免培養基沾污棉塞)。待培養基凝固后，即成斜面(圖73)。2營養瓊脂培養基(肉膏、蛋白陳、瓊脂培養基)營養瓊脂培養基是一種固體培養基，本實驗制備后可供活性污泥純種

25、分離和細菌總數測定之用。(1)成分蛋白陳 2.5g牛肉膏 0.75g氯化鈉 1.25g瓊脂 2.55g蒸餾水 250mL(2)制法1)將上列成分混合后，煮沸至瓊脂完全溶解。2)用蒸餾水補充因蒸發而損失的水量。3)調整溶液的pH值為7.47.6。4)乘熱用紗布或脫脂棉過濾(最好用保溫漏斗)，并分裝于試管中，每管約裝1015mL。如裝在錐形瓶中，則250mL的錐形瓶，以裝100mL左右為宜。管口或瓶口均以棉花塞住。5)置高壓蒸汽滅菌器中，以121(1kgcm2)滅菌20min，然后貯存于冷暗處備用。(三)無菌水的制備在試管或瓶內先盛以適量的自來水(不用蒸餾水，管口或瓶口用塞子塞好，并用牛皮紙扎緊)

26、，使其滅菌后，其水量恰為9mL(用管)或99mL(用瓶)。此種適量的水體積可在滅菌器內由實驗求得。也可以先將管或瓶滅菌，再用滅菌的吸管(所謂無菌吸管)取滅菌的自來水9mL或99mL加入管或瓶中。無菌水常用來稀釋水樣。(四)高壓蒸汽滅菌上面所準備好的一切玻璃器皿、培養基等均需進行滅菌。本實驗用高壓蒸汽滅菌器滅菌，其操作和注意事項如下：1加水 熱源為煤氣燈或電爐者，需先加水至器內底層隔板以下13處。有加水口的，水由加水口加入，由玻璃管看水位至止水線即停止加水。若熱源為蒸汽，則不必加水。2把需要滅菌的器物放入滅菌器內，關嚴滅菌器蓋，勿使漏氣。3打開出氣口。4點火。如熱源為蒸汽，則應慢慢打開蒸汽進口，

27、不要讓蒸汽過猛地沖入滅菌器內。5器內水沸騰以后，蒸汽逐漸驅除器內原有的冷空氣。如滅菌器裝有溫度計，當指針指到讀數100時，證明器內已經充滿蒸汽、可以關閉出氣口。如沒有溫度計，則當出氣口排出的蒸汽相當猛烈時，可以認為滅菌器內冷空氣已經全部被蒸汽驅盡，可以關閉出氣口。這一點應持別注意，因為如果冷空氣沒有排盡，器內雖然達到了一定的壓力，但并不會達到相應所需的溫度。6關閉出氣口后，器內蒸汽將不斷增多，壓力和溫度隨著升高。當蒸汽壓達到所需的壓力時，即為滅菌開始時間，這時要調節火力大小，以維持所需的壓力。滅菌時間的長短由滅菌物品決定。玻璃器皿、無菌水、營養瓊脂培養基可用1kgcm2 (121)的壓力滅菌2

28、0min，合糖的培養基用0.7kgcm2(115)的壓力20min。7滅菌時間到達后，停止加熱。8待壓力指針降到“0”時，打開出氣口。如過早打開，管內和瓶內的培養基會因壓力驟降，而溫度并不同時很快下降，以致培養基翻騰，沾污錦塞。9揭開器蓋，取出滅菌的物品，將器內剩余的水放掉。10待已滅菌的物品冷卻后，置陰涼處。本實驗，除學習培養基制備和高壓滅菌法外，還要為下次實驗作好難備。所以所用培養皿、吸管、試管、錐形瓶、燒杯等玻璃器皿以及無菌水、培養基等的量均須根據下次實驗所需準備。四、思考題1培養基是根據什么原理配制的?營養瓊脂培養基中的成分各起什么作用?2為什么濕熱滅菌比干熱滅菌優越?實驗六 微生物的

29、染色一、目的學習微生物涂片染色的操作技術、掌握微生物的革蘭氏染色法。二、實驗器材1菌種(由實驗室提供)。2顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈等。3染料革蘭氏染色劑1)草酸銨結晶紫染色液甲液 結晶紫 2.5g 95酒精 25mL乙液 草酸銨 1g 蒸餾水 100mL混合甲、乙兩液即成。2)碘液碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300mL先將碘化鉀溶解在一小部分水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，然后加入其余的水即成。3)沙黃染色液沙黃(蕃紅) 2.5g95酒精 100ml取上述配好的沙黃酒精溶液10mL與90mL蒸溜水混勻，即成沙黃稀釋液，作革蘭氏染色用。三、操作方法及步驟革蘭氏染色1將實驗所供菌種按單染色法

30、作涂片、干燥并固定。2在涂面上，加草酸銨結晶紫染色液一滴約1min后，水洗。3加碘液1min后，水洗。4斜置載玻片于一燒杯之上，滴加95酒精脫色，并輕輕搖動玻片，至流出的酒精不現紫色時立即停止滴加(約滴加0.51min)，隨即水洗。為了節約酒精，也可將酒精滴至涂片上，靜置0.51min后水洗。酒精脫色程度必須嚴加掌握。如脫色過度，則陽性菌會被誤染為陰性菌，而脫色不夠時，陰性菌將被誤染為陽性菌。5加沙黃復染液0.5min，水洗。6吸干，置于油鏡下觀察，陽性者為紫色，陰性者為紅色。四、思考題1微生物的染色原理是什么?2你用革蘭氏染色法染色后看到的細菌是什么顏色，屬于革蘭氏陰性還是陽性?革蘭氏染色法

31、在微生物學中有何重要意義?3革蘭氏染色法中若只做14的步驟而不用沙黃復染液復染，是否能分出革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，為什么?4微生物經固定后，是死了呢還是仍活著?實驗七 微生物純種分離、培養及接種技術本實驗的對象是水樣或活性污泥中微生物的純種分離和培養。通常，在處理不同水質的廢水時，起作用的微生物群和種類也不同。我們除可用顯微鏡直接觀察微生物形態，大致了解其中的微生物種群外，更重要的還必須研究是哪些種類的微生物對該種廢水起生物氧化作用，其作用原理是什么，產生什么產物等等，以便提高處理效果。此外，有時我們還需從土壤環境中分離和培養純菌種來處理工業廢水。因此，為了從事以上這些研究工作，就必須學習

32、微生物純種分離、培養及接種的技術，進而再學會做微生物生理生化反應的實驗，為廢水處理服務。在給水處理的細菌檢查中，細菌的分離、培養和接種也是一個重要環節。微生物純種分離的方法有兩種：稀釋平板法和平板劃線法。在本實驗中仍要學習這兩種方法。一、目的要求    掌握幾種常用的分離純化物的基本操作技術。二、基本原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個方面： 1選擇適合于待分離微生物的生長條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其它微生物生

33、長的環境，從而淘汰一些不需要的微生物； 2微生物在固體培養基生長形成的單個菌落可以是一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲得單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計數來完成的。   純培養的確定：   1確定其菌落觀察特征；   2結合顯微鏡檢測個體形態特征的確定。三、實驗器材1無菌培養皿(直徑90mm)、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌試管、5管無菌水(每管有9mL滅菌過的自來水)。2營養瓊脂培養基(已滅菌的) 、水樣或活性污泥。3接種環、酒精好(或煤氣燈)、恒溫箱(培養箱)

34、等。以上器材，除水樣或活性污泥、接種環、恒溫箱外，均在實驗五中準備好。四、操作方法及步驟(一)活性污泥的純種分離與培養1稀釋平板分離(1)取樣(2)稀釋水樣1)將5支裝有9mL無菌水的試管以0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001（或101、102、103、104、105）依次編號。2)以無菌操作，用1mL的無菌吸管吸取1mL樣品于第一管無菌水中，將吸管吸洗3次，搖勻，即為稀釋10倍的菌液。再從此0.1濃度的菌液中吸取1mL于第二管中，將吸管吸洗3次，搖勻，即為稀釋100倍的菌液，以同樣方法，依次類推，分別得到稀釋103倍、104倍及105倍的菌液，所得菌液分別為0.1、0.

35、01、0.001、0.0001及0.00001(即101、102、103、104及105)等濃度。(3)平板的制作I)將無菌培養皿編號為0.1、0.01、0.00001(101、102、105)。2)另取一支lmL的無菌吸管從濃度小的105的菌液開始，依次分別取0.5mL菌液于相應編號的培養皿內(每個濃度做3個平板)。每次吸取時，吸管都應在菌液中反復吸洗幾次。3)在稀釋菌液的同時，就要將營養瓊脂培養基加熱融化，待融化的培養基冷到40一50°C左右(溫度不可過高，否則微生物容易被燙死，溫度過低，培養基容易凝固，平板不平)時，傾注10一15mL入上述盛有菌液的培養皿內(每一培養皿內應加入

36、的培養基量須根據皿的大小決定，以能使培養皿底部鋪滿培養基而形成厚約23mm的薄層為適當，在直徑為90mm的培養皿內注入1015mL，可滿足此要求)，如圖72所示。在傾注前，應先將盛有培養基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微燒一周。培養基傾入后迅速蓋上皿蓋，培養基傾入后平放桌上，輕輕轉動，使培養基和稀釋菌液充分混合均勻，冷卻后，即成平板。將培養皿倒置于30°C的恒溫箱中培養24h，觀察有無菌落長出。培養皿所以要倒置是為了防止培養基內水分蒸發到皿蓋上而使培養基變干。2平板劃線分離。(1)取樣 同前。(2)制備平板培養基 將融化的營養瓊脂培養基以無菌操作倒入無菌的空培養皿內(操作方法同前，

37、但培養皿內末注入菌液)。加蓋，在平桌上轉動，凝固后即成所需的平板。(3)劃線 以無菌操作，右手持經燒灼滅菌冷卻的接種環從裝有活性污泥的器皿中取一環活性污泥。同時左手持培養皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀起一些，右手把接種環伸入培養皿，將一環活性污泥在平板表面輕輕地劃線(千萬不要戳破培養基平板)，可作平行劃線、扇形劃線，或其它連續劃線。無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。劃線后，將皿蓋蓋好。倒置培養皿于30°C恒溫箱內培養24h，則平板上即長出菌落。接種環用過后即再燒灼滅菌。(二)其它一些接種的

38、操作技術微生物的接種方法，除前面所提到的外，隨著所用的培養基、實驗目的等的不同，還有好幾種，但是它們的基本操作都是類似的，并且都要嚴格注意無菌操作。1斜面接種技術 這是將微生物從一個斜面培養基(或平板培養基)上接種到另一個斜面培養基上的方法，見圖810。斜面培養基可用小試管(15mm×150mm)制備，每管約裝3一5mL(14一13試管高度)，見圖73。(1)將試管貼上標簽、注明菌名、接種日期等。(2)將培養好的菌種和斜面培養基的兩支試管用大拇指和其它4指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分。斜面向上，管口齊平，并使它們位于水平位置。(3)將棉塞用右手擰轉松動，以利接種時拔出。(4

39、)右手拿接種環，在火焰上將環燒灼滅菌，環上凡是在接種時可能進入試管的部分都應用火燒灼。(5)在火焰旁，用右手拔掉棉塞。(6)以火焰微燒試管口一周，燒灼時應不斷地轉動管口，使管口上可能沾污的少量菌或帶菌塵埃得以燒去。(7)將燒過的接種環伸入菌種管內，先將環接觸沒有長菌的培養基部分(如斜面的頂端)，使其冷卻，以免燙死被接種的菌種。然后輕輕挑取少許菌種，抽出接種環并迅速將接種環伸進另一試管，在培養基上輕輕劃線(由底部向頂部劃線)。(8)接種完后，將接種環取出，將試管塞好棉塞。2液體接種 這是由斜面培養基(或平板培養基)接種到液體培養基中的方法。(1)操作方法與前同，試管可略向上斜，以免培養基流出。(

40、2)將取有菌種的接種環送入液體培養基時，可使環在液體表面與管壁接觸的部分輕輕摩擦，接種后，塞上棉塞。將試管在手掌內輕輕轉動，使菌體在培養基中均勻分散。3由液體培養基接種液體培養基 接種用具常用無菌吸管或無菌滴管。無菌操作注意事項與前同，吸管或滴管要預先經干熱或濕熱法滅菌，不能在火焰上燒灼。具體操作較簡單，只要用無菌吸管或滴管從有菌的試管吸取一定量的培養液到另一管液體培養基中，塞好棉塞即可。4穿刺接種 這是由斜面菌種接種到固體深層培養基的方法。培養基可裝于大試管(20mm×220mm)內，每管約裝1215mL。(1)如前斜面接種操作，但用接種針(必須很挺直)取出少許菌種。(2)用左手斜

41、握盛有固體深層培養基的試管，用右手將接種針移入培養基，自中心刺入，直到接近管底，但不要穿透。然后沿穿刺途徑緩慢將針拔出。這樣，接種線整齊，易于觀察。將以上分離、接種的培養物置于恒溫箱中在一定溫度下培養一定時間后觀察結果。接種環和接種針用畢后均應再燒灼滅菌。微生物的分離、培養、接種等操作，前已述及，最好在經紫外線滅菌的無菌室內或無菌箱內進行，要嚴格注意無菌操作。在沒有無菌室或無菌箱的情況下，實驗精度又要求不高時，則可在一般的實驗室內進行，但必須特別注意無菌操作。五、思考題用一根無菌吸管取幾種濃度的水樣時，應從哪一個濃度開始?為什么?實驗八 純培養菌種的菌體、菌落形態觀察本實驗是將實驗七中分離出來

42、的幾種微生物為材料，進行菌體形態、菌落形態特征的觀察。并通過革蘭氏染色，以了解活性污泥中大體由哪些類群的微生物所組成。一、實驗器材1顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈。2革蘭氏染色液全套。3實驗七培養出來的各種菌種。二、實驗內容和方法1接種斜面培養基 將已經分離培養出來的幾種不同形態特征的菌落在無菌操作條件下，用接種環分別挑取少許菌種接種到各個斜面培養基上，塞好棉塞，放在試管架上，置于30恒溫箱中培養36h后，進行觀察。2菌落形態特征的觀察 由于微生物個體的表面結構、分裂方式、運動能力、生理特性以及產生色素的能力等各不相同，因而個體在固體培養基上的情況各有特點。按照微生物在固體培養基上形成的菌落的

43、特征，可粗略地辨別是何種類型的微生物。應注意菌落的形態、結構、大小、菌落高度、顏色、透明度、氣味及粘滯性等。一般來說，細菌和酵母菌的菌落比較光滑濕潤，用接種環容易將菌體挑起。放線菌的菌落硬度較大，干燥致密，且與基質緊密結合，不易被針或環挑起。霉菌菌落常長成絨狀或棉絮狀。如果要鑒定菌種，則對微生物在斜面培養基上及液體培養基中生長的特征都應比較詳細地觀察。在斜面培養基上觀察菌落生長旺盛程度、形狀、顏色及光澤等。在液體培養基中則觀察渾濁度、有無沉淀、液體表面生膜與否、膜的形狀等。在穿刺接種時則觀察菌落在基質表面的情況、菌落的延伸情況以及是否液化培養基和液化的情況等。觀察時繪出菌落形態特征圖。本實驗只

44、學習觀察一般微生物菌落形態待征，不作菌種鑒定。所以，只做瓊脂平板和瓊脂斜面的觀察，并同時結合微生物個體形態觀察，以達到了解和熟悉幾種微生物的菌落形態和個體形態持征。3微生物個體形態觀察 在觀察了已培養好的各種微生物菌落形態以后，用革蘭氏染色法染色，進行顯微鏡油鏡的觀察，并繪制形態圖。三、記錄1、菌落形態特征的觀察菌落序號形態邊緣菌落直徑菌落高度顏色透明度氣味粘滯性2、微生物個體形態觀察序 號玻片名稱放大倍數形態草圖三、思考題你從樣品中分離出幾種微生物?其菌落形態和個體形態是怎樣的?革蘭氏染色呈什么反應。實驗九 微生物的生理生化特性微生物的代謝與呼吸，主要依賴于酶的活動。各種微生物具有不同的酶類

45、，因此，它們對某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情況不同，代謝產物也有所不同。所以，我們可以利用各種微生物生理生化反應的特點來作為鑒別它們的一種依據。本實驗以大腸菌群為例子。一、實驗目的在水處理工程中，水源水要經過處理后才能供給用戶。飲用水要求清澈、無色、無臭，更重要的是沒有病原菌。因此，自來水在出廠以前要作水質的物理化學分析和細菌檢驗，本實驗結合給水凈化工程中的細菌檢驗，作細菌總數和大腸菌群的測定。通過大腸菌群的測定，了解大腸桿菌的生理生化特性。大腸菌群數系指每升水樣中所含有的大腸菌群的數目。大腸菌數一般包括大腸埃希氏桿菌、產氣桿菌、枸椽酸鹽桿菌和副大腸桿菌。本實驗的發酵試驗采用含有乳糖的

46、培養基，故測定結果不包括副大腸桿菌。細菌總數是指1mL水樣在營養瓊脂培養基中，于37°C經24h培養后，所生長的細菌菌落的總數(實際上所表示的是腐生細菌的數目。腐生細菌在營養瓊脂培養基上所形成的菌落呈白色細點狀)。我國現行生活飲用水衛生標準GB574985規定：細菌總數是指1mL水中不得超過100個，大腸菌群1L水中不得超過3個。二、實驗用具1水樣瓶 任何具有玻璃塞、質量良好的玻璃瓶都可用。2吸管、試管、錐形瓶等。3稀釋瓶 稀釋水樣所用的玻璃瓶最好為瘦長形，并具有嚴密的玻璃塞，其容量要比實際用的水量大二倍，有時可在普通試管上加塞，作為稀釋管。瓶口或管端須以紙或紗布包好扎緊。4培養皿(

47、平皿) 般采用直徑90mm，高15mm的。5發酵管和發酵瓶(圖811) 發酵管有大小之別，小發酵管可用15mm×150mm的試管，大發酵管和發酵瓶須有200mL以上的容量。管和瓶內都須裝倒置的小試管(直徑一般510mm、長20一40mm，小發酵管取用較小的小試管，大發酵管和發酵瓶取用較大的小試管)，這種小試管常稱為倒管，用以聚集氣體。6接種環。7細菌濾器。8濾膜。9高壓蒸汽滅菌器。l0恒溫箱(培養箱)。11電冰箱。12顯微鏡。13鏡油(香柏油)、二甲苯、擦鏡紙等。14普通放大鏡 能放大五倍以上。15pH電位計(或氫離子濃度比色計或pH精密試紙)。以上是一些主要的實驗用具。測定細菌總數

48、時需要l、2、3、4、9、10、11、14、15等用具；發酵法檢驗大腸菌群時需要1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、15等用具；濾膜法檢驗大腸菌群則基本上需要上述全部用具。三、培養基及染色試劑本實驗所需培養基及染色試劑有如下幾種：營養瓊脂培養基 供細菌總數測定用乳糖蛋白胨培養基 供大腸菌群檢驗“發酵法”用濃乳糖蛋白胨培養基 同上品紅亞硫酸納培養基（甲） 同上品紅亞硫酸鈉培養基（乙） 供大腸菌群檢驗“濾膜法”用伊紅美藍培養基 供大腸菌群檢驗“發酵法”用乳糖蛋白胨半固體培養基 供大腸菌群檢驗“濾膜法”用革蘭氏染色劑 供大腸菌群檢驗用上述各種培養基及染色劑的成分與配制方法如下：(一)

49、營養瓊脂培養基成分及制法見實驗五。(二)乳糖蛋白胨培養基1成分蛋白胨 10g牛肉膏 3g乳糖 5g氯化鈉 5g1.6溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸餾水 1000mL2制法(1) 將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調整pH為7.27.4。(2) 加入1.6溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于小發酵管（內有倒管）中，每管裝10mL。(3)置高壓蒸汽滅菌115（0.7kg/cm2）滅菌20min。(4)貯存于冷暗處備用。(三)濃乳糖蛋白胨培養基按上述“乳糖蛋白胨培養基”濃縮3倍配制。分裝于發酵瓶或發酵管（內有倒管）中，每個發酵瓶或大發酵管裝50mL，每個小發酵管裝6mL。

50、（四）品紅亞硫酸鈉培養基(甲)1成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 3.5g瓊脂 2030g蒸餾水 1000mL無水亞硫酸鈉 5g左右5堿性品紅乙醇溶液 20mL2儲備培養基的制備(1)先將瓊脂加至900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使溶解，再以蒸餾水補足至1000mL，調整pH為7.27.4。(2)趁熱用脫脂棉或紗布過濾(最好用保溫漏斗)，再加入乳糖，混勻后定量分裝于錐形瓶內，置高壓蒸汽滅菌器中以115（0.7kg/cm2）滅菌20min，貯存于冷暗處備用。3平板的制備(1)將上法制備的儲備培養基加熱融化。(2)根據錐形瓶內培養基的量，用無菌吸管按比例吸取一定

51、量的5堿性品紅乙醇溶液置于無菌空試管中。(3)根據錐形瓶內培養基的量，按比例稱取所需的無水亞硫酸納置于無菌空試管內，加無菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min以滅菌。(4)用無菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液中至深紅色褪成淡粉紅色為止。(5)將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加于已融化的儲備培養基內，并充分混勻(防止產生氣泡)。(6)立即將此種培養基適量傾入己滅菌的培養皿內(90mm直徑的培養皿約需培養基10一15mL)，待其冷卻凝固后置冰箱內備用。此種己制成的培養基于冰箱內保存亦不宜超過二周。如培養基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。(五)品紅亞硫酸鈉培養基(乙

52、)1成分蛋白胨 10g酵母浸膏 5g牛肉膏 5g乳糖 10g瓊脂 20g磷酸氫二鉀 3.5g無水亞硫酸鈉 5g左右5堿性品紅乙醇溶液 20mL蒸餾水 1000mL2培養基及平板的制備方法與“品紅亞硫酸鈉培養基(甲)”的制備法相同，但須加酵母浸膏和牛肉膏。(六)伊紅美藍培養基1成分蛋白陳 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 2030g蒸餾水 1000mL2%伊紅水溶液 20mL0.5%美藍水溶液 13mL2儲備培養基的制備(1)先將瓊脂加入900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使溶解，再以蒸餾水補足至1000Ml，調整pH為7.27.4。(2)趁熱用脫脂棉或紗布過濾(

53、最好用保溫漏斗)，再加入乳糖，混勻后定量分裝于錐形瓶中，置高壓蒸汽滅菌器內以115(0.7kgcm2)滅菌20min。貯存于冷暗處備用。3平板的制備(1)將上法制備的儲備培養基加熱融化。(2)根據錐形瓶內培養基的量，用無菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2伊紅水溶液及一定量已滅菌的0.5美藍水溶液加入已融化的儲備培養基內，并充分混勻(防止產生氣泡)。(3)立即將此種培養基適量傾入已滅菌的培養皿內(對于90mm直徑的培養皿1015mL)，待其冷卻凝固后，置冰箱內備用。(七)乳糖蛋白胨半固體培養基1成分蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 5g乳糖 10g瓊脂 5g左右蒸餾水 1000mL2制法(1)將上述成分加熱溶解于800mL蒸餾水中，調整PH為7.27.4，在用蒸餾水補充至l000mL，過濾。(2)分裝于試管中，每管裝入的培養基量均為試管容