1、配膠配膠樣品制備樣品制備電泳（電泳（1.52h）染色（染色（20min）脫色（脫色（30min2h）分析分析配分離膠配分離膠(下膠下膠)配濃縮膠配濃縮膠(上膠上膠)BG-verMINI型迷你垂直電泳槽型迷你垂直電泳槽 (北京百晶北京百晶)2.2.凝膠配制凝膠配制 * *AcrAcr有神經毒有神經毒 性性凝膠配制過程要迅速凝膠配制過程要迅速, 催化劑催化劑TEMED要在注膠前再加入要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡避免產生氣泡.1cm下膠高度，距齒下1cmAB 水封平齊，排氣泡平齊，排氣泡加速聚合加速聚合C棄水層棄水層凝

2、固凝固D灌上膠，插梳子梳需平穩插入梳需平穩插入,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡,梳底需水平梳底需水平出現明顯界面時，出現明顯界面時，分離膠凝聚完成分離膠凝聚完成（ 1020min）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用加樣槍并用加樣槍/ /濾紙濾紙吸干吸干v制備分離膠制備分離膠(下膠下膠) 封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。加入濃縮膠溶加入濃縮膠溶液液 pH 6.8pH 6.8v制備濃縮膠制備濃縮膠(濃縮膠濃縮膠)樣梳需一次平穩插入樣梳需一次平穩插入, ,梳梳口處不得有氣泡口處不得有氣泡, ,梳底需梳底需水平。水平。插入樣品梳插入樣品梳

3、1. 1. SDS2. 2. - mercaptoethanol 3. 3. bromophenol blue4. 4. GlycerolSample buffer樣品處理樣品處理ssSHSH金屬金屬浴浴(100)中中15minSample bufferA. 樣品加熱，上樣樣品加熱，上樣B. 電泳電泳+（1）上膠）上膠 恒壓恒壓80V (8V/cm)（2）下膠）下膠 恒壓恒壓120V (12V/cm)v上樣及電泳上樣及電泳Staking gelSeparating gel負極負極正極正極內槽內槽外槽外槽凝膠凝膠外槽外槽A. 染色染色20分鐘分鐘B. 脫色30分鐘至2小時考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭R2

4、50CH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNH2OCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNHOCH2CH2CHCNHOCH2CHCNH2O( )nCH2CHCNH2O( )n+* *AcrAcr有神經毒有神經毒 性性n決定了交聯度與濃度一起決定孔徑的大小過硫酸銨是催化劑TEMED是加速劑蛋白質是29：1核酸是19：1C

5、l-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要離子主要離子氯離子氯離子甘氨酸離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質離子蛋白質離子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8加加 樣樣 緩緩 沖沖 液液二硫鍵二硫鍵鹽鍵鹽鍵疏水作用疏水作用氫鍵氫鍵巰基乙醇巰基乙醇斷二硫鍵斷二硫鍵SDSCH3SO4Na斷化學鍵斷化學鍵帶負電荷帶負電荷甘油甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸側鏈氨基酸側鏈SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉促沉溴酚蘭溴酚蘭Tris?Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主

6、要離子主要離子氯離子氯離子甘氨酸離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質離子蛋白質離子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢離子的產生快慢離子的產生高的電壓梯度高的電壓梯度Pr-運動加速運動加速Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子主要離子氯離子氯離子甘氨酸離子甘氨酸離子 (pI 5.97)蛋白質離子蛋白質離子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢離子的產生快慢離子的產生高的電壓梯度高的電壓梯度Pr-運動加速運動加速濃縮效應濃縮效應pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-

7、Cl-主要離子主要離子氯離子氯離子甘氨酸離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質離子蛋白質離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加甘氨酸解離增加無快慢離子無快慢離子Pr-根據分子量運動根據分子量運動分子篩效應分子篩效應Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH6.8主要離子主要離子氯離子氯離子甘氨酸離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質離子蛋白質離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加甘氨酸解離增加無快慢離子無快慢離子Pr-根據分子量運動根據分子量運動分子篩效應分子篩效應Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl

8、-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH6.8pH8.85%10%lgMw電泳遷移率lgMw=-bx+KPr Mw在11.7-165KdpH6.8pH8.85%10%遷移率遷移率=蛋白質移動的距離蛋白質移動的距離脫色后的膠長脫色后的膠長染色前膠長染色前膠長指示劑移動的距離指示劑移動的距離遷移率遷移率=“蛋白質移動的距離蛋白質移動的距離”指示劑移動的距離指示劑移動的距離染色前染色前染色后染色后蛋白質的帶在哪呢？蛋白質的帶在哪呢？L1L2L3L4LxL1 X L3L2 X L4PageRuler Prestained Protein Ladder A pres

9、tained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.1. 采用此法測蛋白質分子量時，必須完全打開二硫鍵。采用此法測蛋白質分子量時，必須完全打開二硫鍵。2. 多亞基蛋白問題多亞基蛋白問題3. 有些蛋白質不能用有些蛋白質不能用SDS-PAGE測定分子量。如電荷測定分子量。如電荷異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。976644292014IPTG

10、誘導表達His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1為誘導前，26分別為誘導0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 電泳過程中的不正常現象電泳過程中的不正常現象1 “微笑”現象指示劑前沿呈現兩邊向上的曲線形，主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續實驗。2 皺眉現象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當明膠和玻璃板組成的“三明治底部有氣泡”或靠近隔片的凝膠聚合不完全處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 3 “拖尾”現象樣品溶解不佳引起或分離膠濃度過大 解決辦法：加樣前離心選擇合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液加增溶試劑降低

11、凝膠濃度4 “紋理”現象樣品中的不溶性顆粒引起的解決辦法：增加溶解度離心除去不溶性顆粒5 偏斜現象電極放置不平行或加樣位置偏斜引起6-2 整塊膠分離的條帶太寬主要是未濃縮好的原因 處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的 pH 正確 （6.7） ；適當降低電壓； 6-1 某一條泳道條帶太寬加樣量太多或者加樣孔泄露引起7. “鬼帶” “鬼帶”就是在跑大分子、構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻與目標條帶有相同的免疫學活性， WB 反應中可見其能與目標條帶對應的抗體