1、基因工程制藥綜述班級：生技132姓名：學號：大腸桿菌表達系統的研究進展綜述自上世紀70年代以來，大腸桿菌一直是基因工程中應用最為廣泛的表達系統。盡管基因工程表達系統已經從大腸桿菌擴大到酵母、昆蟲、植物及哺乳動物細胞，并且近年來出現了很多新型的真核表達系統，但是大腸桿菌仍然是基因表達的重要工具。尤其是進入后基因組時代以來，有關蛋白結構以及功能研究的開展，對基因表達的要求更高，這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇。文章綜述了近年來有關大腸桿菌表達載體及宿主細胞的改造工作。1. 1表達載體1表達調控構建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求，同時也是影響基因表達水平以及蛋白活性的重要因素。標準的大腸桿菌

2、表達載體的主要組成：啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始區、多克隆位點、終止子、復制起點以及抗性篩選因子等。理想的表達載體要求在轉錄和翻譯水平上可以控制目的基因的表達，然而目的基因在宿主體內過分表達（選用較強的啟動子等）會對宿主造成壓力，引起相關的細胞應答反應，影響蛋白的活性等。基因組、RNA轉錄組、蛋白質組、代謝調控組等領域的研究成果給我們提供了大量關于基因表達調控的信息1。現已能從基因和細胞的整體水平來方便地選擇合適的啟動子或合理開發新的載體系統。譬如Lee等利用二維凝膠電泳法比較了重組載體和空載體被分別轉入宿主細胞后蛋白組學的差異,發現兩者都產生了大腸桿菌熱休克蛋白并引起了cAMPC

3、RP調節蛋白的應答，其中重組子的影響更為強烈；另外，還發現外源基因的表達使宿主核糖體合成速率、翻譯延長因子和折疊酶表達水平、細胞生長率下降，而使細胞呼吸活力上升2。目前應用的表達載體主要問題是表達過程中出現的全或無的情況，通常表達的培養物都是非純種的細胞群，其中有一些細胞可以最大限度地被誘導，而另一些細胞在誘導后基因的表達被關閉。分離具有合適強度啟動子及翻譯速率的載體變種可以優化表達水平，說明啟動子的選擇對于基因的誘導表達非常重要。Deborahat提出在芯片上排列具有不同強度級別啟動子的載體進行互補分析，可能有助于篩選最為適合的啟動子3。開發非IPTG或阿拉伯糖誘導的載體也可以提高基因表達水

4、平，Qing等利用cspA基因的獨特性開發了一系列冷休克表達載體pCold,使目的基因在低溫下（15C）誘導表達，提高了產物的溶解性和穩定性4。1.2 融合表達載體除了表達載體的調控性，為了提高蛋白產物的活性以及簡化下游純化的操作等，往往在表達載體上插入其它輔助的基因序列與目的基因構成融合蛋白表達。融合信號肽（PelB、OmpA、MalE、PhoA等）表達可以使融合蛋白通過經典的Sec途徑分泌到周質或胞外表達，有利于形成二硫鍵以及避免胞質蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。另外，最近開發的雙精氨酸轉運體系（Tat）可以有效分泌正確折疊的重組蛋白5。常見的純化標簽多根據親和層析的配體來選擇，如6H

5、is、GST、CAT、MBP等經過一步親和純化可以得到均一性較高的產物,但化學洗脫會對產物的活性產生一定的影響。Ca2瓶賴的鈣調蛋白結合肽（CBP）和鏈球菌親和素結合肽（SBP）作為純化標簽時，只需要在洗脫液中移去標簽依賴的離子或小分子就能實現溫和的特異性洗脫6,7。再者，應用一些非層析的純化標簽在純化操作中非常經濟實用，如熱敏型的類彈性蛋白多肽（ELPs）可以使蛋白產物在溶解態和非溶解態之間轉變后續應用逆轉循環的純化方法可以達到親和純化的回收率同。另外，在純化標簽與目的蛋白之間插入一些特殊的短肽，同時融合剪切酶可以在純化操作中利用標簽的自剪切直接得到產物蛋白。例如SrtAc酶所識別的短肽序列

6、GTEPL,在蛋白N端依次連接短肽、剪切酶、6His融合表達，親和上柱后剪切酶發揮作用使N端帶有Gly的目的蛋白從融合狀態中釋放出來陰。噬菌體展示庫是表達抗體或其它蛋白庫的重要克隆技術，與之相似將目的基因同適合的錨定序列融合可以使產物蛋白表達到大腸桿菌的表面。大腸桿菌展示所用的融合配體一般為細菌的膜蛋白或跨膜轉運體，如PadL是大腸桿菌長鏈脂肪酸的一種外膜轉運體蛋白,N端融合PadL表達胞內酶，以全細胞的形式催化反應表現出非常高的穩定性阿；Yang等利用惡臭假單胞菌Pseudomonasputida外膜酯酶EstA的轉運結構域作為表達胞內3-內酰胺酶的錨定基序，結果表明蛋白展示在細胞膜外并沒有

7、影響細胞的活力11。1.3 共表達載體很多真核基因表達的產物都必須以多聚復合體的形式組合才能表現出相應的活性，因此在表達這一類目的基因的時候常構建共表達載體，另外共表達的策略在輔助新生蛋白質的折疊和分泌中也很有意義。Dzinenu等針對表達異源二聚體構建了可以同pET載體共表達的載體pOKD,這種載體含有p15A復制起點，所以可以和大多數大腸桿菌表達載體共存于細胞中12。細菌釋放素蛋白（BRP）屬于細菌中的一類分泌蛋白，共表達目的蛋白與BRP可以促進產物直接釋放到培養基中13。另外，共表達分子伴侶也是促進蛋白正確折疊的手段。目前對于分子伴侶構成的網絡模式還處于探索階段，研究發現大腸桿菌中常見的

8、分子伴侶GroEL、Hsp同系物DnaK并非細胞內所有蛋白折疊所必需的，只有同核糖體結合的觸發因子協調作用才能促進蛋白的適當折疊阿。但是，合理選擇個別的分子伴侶共表達可以避免產物在細胞內錯誤的折疊以及沉積。Marco等設計了共表達分子伴侶的3載體系統，其中兩種載體分別攜帶不同的分子伴侶，另外一種載體攜帶目的基因，分子伴侶與目的基因被分別獨立誘導14。Cpn60和Cpn10是從嗜冷菌中分離的一類分子伴侶，共表達后可以使大腸桿菌在4C低溫下生長，有利于蛋白的正確折疊15。與分子伴侶類似，共表達DsbA或Dsbc等二硫鍵相關蛋白可以輔助形成正確的二硫鍵。1.4 雙雜交系統融合表達和共表達的另一個應用

9、是利用雙雜交系統研究蛋白質的相互作用。大腸桿菌雙雜交系統也是有3種載體構成，誘餌蛋白融合表達載體、捕獲蛋白融合表達載體和報告基因表達載體16。以AraC/LexA雙雜交系統為例，誘餌載體的啟動子選用IPTG誘導的pTrc,誘餌蛋白融合在轉錄激活因子ArcC的N端表達，帶有卡那霉素的抗性基因；捕獲載體的啟動子選擇非IPTG誘導的pTet,可以在去水四環素的誘導下轉錄，捕獲蛋白融合在LuxA操縱子效應物LuxA的N端，帶有氨芳青霉素的抗性基因；報告基因LacZ的啟動子選用大腸桿菌的araBAD啟動子，其活性依賴于上游的AraC操縱子，同時在啟動子下游安置3個定向重復的LexA操縱子半位點，載體帶有

10、大觀霉素的抗性基因，另外在AraC上游插入4個串聯的rrnB終止子，減小轉錄通讀對報告基因活性的背景影響。此3載體共表達系統的特點是誘餌蛋白同捕獲蛋白分別獨立誘導，可以通過控制誘導物的濃度逐步放大雜交蛋白相互作用對報告基因表達的抑制效應。誘餌蛋白與捕獲蛋白分別結合在上游和下游的2個操縱子上，如果二者可以發生雜交作用，則在報告基因的DNA鏈上形成突環，使AraC轉錄激活效應發生逆轉，所以通過菌落的藍白斑差異可以篩選出發生相互作用的蛋白質。1.5 Univector系統通常在構建重組子表達時需要依賴限制性內切酶和連接酶的作有，進行亞克隆，而利用同源重組開發的載體可以實現基因的一次性克隆。Unive

11、ctor表達系統(UPS)就是這方面較為成功的實例16。Univector系統由兩類載體組成(圖1):一種稱為萬能的進入載體pUN1,具有特殊的loxP重組序列，通過重組酶Cre可以方便地穿梭進入表達載體；另一種即表達載體pHOST,同樣具有loxP序列，pHOST是由不同的啟動子與融合標簽組成的載體系列，便于高通量篩選蛋白產物。Univector系統的特點是平行獨立克隆到多載體中，使之在不同的誘導條件下表達，大大提高了表達的成功率，尤其在蛋白組的研究中具有很大的應用潛力網。2宿主細胞在大腸桿菌細胞內表達目的基因的主要優勢：一個是宿主的遺傳背景比較清楚，易于控制基因的表達；另一個是大腸桿菌容易

12、培養，可以獲得較高產量的目的蛋白。但是在商業應用中很多的蛋白產物是真核基因編碼，并且具有高級的三、四級結構，要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細胞的分子環境和折疊機制等與真核細胞具有很大的差異，所以在應用大腸桿菌系統表達真核基因時有必要利用代謝工程或進化的方法改造細胞，解決大腸桿菌表達系統的局限性，提高產物的活性。2. 1代謝工程載體攜帶目的基因進入宿主表達會給宿主本身造成代謝上的負擔，影響細胞的生長速率等，推測可能是因為宿主不能提供足夠外源基因表達所需的原料及能量。減輕表達對于宿主的壓力可以通過控制質粒的拷貝數或者改變載體的抗性基因，還可以將目的基因直接插入染色體中

13、表達。Flores等則是將磷酸戊糖途徑的代謝關鍵酶一6磷酸葡萄糖脫氫酶的基因克隆到多拷貝質粒中，轉化大腸桿菌使細胞的生長速率在誘導后得到恢復17。除了利用大腸桿菌的代謝機制改進表達系統，另外還可以人為地在大腸桿菌中設計代謝途徑，例如Masip等設計的二硫鍵合成途徑。在大腸桿菌中催化二硫鍵形成的是周質蛋白DsbA,此蛋白通過膜蛋白DsbB得到循環利用。Masip等選擇硫氧化還原蛋白TrxA作為二硫鍵的供體，使之在氧化態的胞質內形成二硫鍵，通過融合Tat特異性前導肽從細胞質轉運到周質使重組蛋白在周質獲得二硫鍵。因此這一途徑不依賴DsbADsbS體系，僅通過胞內的硫氧化還原蛋白就能形成二硫鍵，所以可

14、以修復缺失DsbADsbB體系的宿主18。2. 2定向進化通常重組蛋白對于細胞內的蛋白酶都很敏感，為了避免蛋白酶的作用除了分泌表達外還可以對相關的蛋白酶進行突變，例如篩選缺乏ATP依賴的胞內蛋白酶的菌株，但是對于是否細胞因此而上調其它的蛋白酶濃度還不清楚。另外在周質中的蛋白酶也會降解產物蛋白，DegP蛋白是存在于細胞周質中的主要蛋白酶，所以可以應用degP失活的宿主表達蛋白。同時，C端為非極性的蛋白應該在prc突變的宿主中表達(Prc蛋白酶作用于C端非極性的蛋白)，或者以N端融合形式表達19。前文已經提到過選擇分子伴侶的問題，利用定向進化的方法分離分子伴侶或折疊因子的變異體，可以針對重組蛋白進

15、行高效的特異性折疊。Weissman等對大腸桿菌進行多輪的DNA改組和篩選，分離出的GroEL突變體提高了對綠色熒光蛋白的折疊效率20。另外，定向進化的方法還可以擴大大腸桿菌的遺傳密碼，在蛋白中添加非天然的氨基酸。決定氨酰tRNA合酶催化tRNA攜帶正確氨基酸的因素是不同于氨酰化位點的一個編輯位點。通過對染色體的隨機誘變，篩選出一類突變體可以催化tRNAVal結合Ser,并且20%ffl胞內的Val都被類似于Ser的氨基丁酸取代21。Schultz等向大腸桿菌中引入一對特殊的tRNA/氨酰tRNA合酶，摻入對琥珀密碼子應答的甲基化酪氨酸，在表達二氫葉酸還原酶的實驗中發現，由于非天然氨基酸的存在

16、使基因翻譯的保真度達到99需2。2.3蛋白質的糖基化很長時間以來，大腸桿菌被認為不能表達糖基化蛋白，因為原核細胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核細胞中，大多數分泌蛋白都在翻譯后加工過程中獲得N端的寡糖鏈。寡糖(Glc3Man9GlcAc2)被類脂運載體轉運到蛋白的N端，由寡糖轉運酶催化寡糖與天冬酰氨或絲氨酸/蘇氨酸殘基形成N連接或O連接。空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是目前發現的唯一具有類似真核糖基化代謝功能的原核生物，其基因組中的pgl基因簇編碼的蛋白類似于真核細胞中的糖基轉移酶。Wacker等將空腸彎曲桿菌的糖基化基因克隆到大腸桿菌中表達，結果pgl編碼的蛋白PglB可

17、以指導質粒編碼的AcrA蛋白的糖基化。通過對表達產物的分析發現，大腸桿菌與真核細胞表達的糖蛋白在寡糖鏈組成上沒有相似性，但是同樣與AsnXaaSer/Thr的氨基酸殘基結合23。Schultz等將進化突變的方法應用于蛋白的翻譯后加工中，結果獲得了高產率的糖基化的肌紅蛋白。他們從甲烷球菌中分離出酪氨酸tRNA合酶TyrRSs基因，在活性位點進彳T隨機突變，經過幾輪陽性和陰性篩選后得到對3-乙酰氨基葡萄糖-絲氨酸具有特異性的TyrRSs。這種氨酰tRNA合酶可以對琥珀密碼子TAG應答催化形成tRNATyr3GlcNAc又;3GlcNAc的摻入為蛋白的糖基化提供了初級的糖基化位點，可以被糖基轉運酶識

18、別進一步合成復雜的糖鏈。這種方法也可以應用于其它的翻譯后加工中，包括蛋白的甲基化、磷酸化、乙酰化等24。基因的表達過程是一個復雜的過程，涉及基因的轉錄、翻譯、翻譯后加工、細胞的代謝以及細胞內基因與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。進入后基因時代之后，大腸桿菌首先被選作研究蛋白組學、基因功能、蛋白質網絡等新課題的模型，揭示了很多基因表達的未知領域，同時提供了更多發展大腸桿菌表達系統的依據。伴隨分子生物學新技術的涌現，大腸桿菌勢必在實驗研究及工業生產重組蛋白的應用中發揮出更大的作用。參考文獻1 ReedJL,PalssonB.ThirteenYearsofBuildingConstraintBase

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