1、銀杏葉提取物對膠質瘤細胞NFB表達和NO生成的調控         08-05-08 10:15:00     作者：張申，李曉陽，衛濤濤    編輯：studa20【摘要】  目的 研究銀杏葉提取物（EGb761）對C6膠質瘤細胞核轉錄因子B（NFB）表達和可誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）生成的影響。方法 以脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）誘導體外培養的C6膠質瘤細胞表達可誘導型一氧化氮合酶、產生大量NO

2、，應用激光共聚焦成像系統和NO熒光探針監測細胞內NO濃度變化，逆轉錄基因擴增技術和蛋白質印跡技術檢測EGb761對C6膠質瘤細胞中iNOS基因表達的影響，并探討這一調控作用的分子機制。結果 EGb761能明顯降低C6膠質瘤細胞中iNOS mRNA和蛋白的表達、減少NO的生成，抑制IB的降解和阻止p65/RelA進入細胞核。結論 EGb761可通過NFB信號通路對C6膠質瘤細胞iNOS基因表達和NO的生成進行調控。 【關鍵詞】  銀杏葉提取物；膠質瘤細胞；可誘導型一氧化氮合酶；一氧化氮；核轉錄因子B    Regulatory Effect of Gink

3、go Biboba Extract on the Expression of NFB and Nitroxide Production in Glioma Cells     Key words：EGb761; Glioma cell；  iNOS;  Nitric oxide;  NFB    銀杏為最古老的中生代孑遺稀有植物之一，屬裸子植物門銀杏綱銀杏科植物，現僅存一科一屬一種，有裸子植物“活化石”之稱。銀杏樹的根、葉、皮及種子均可藥用。銀杏葉入藥始于明代，傳統醫學用銀杏葉治療哮喘、支氣管炎

4、和老年性心血管疾病，但葉中含有氫氰酸，可加速心率，副作用大。20世紀60年代后，德、法等歐洲國家先后開展了對銀杏葉的研究。1965年，德國威瑪舒培博士(Dr. Willmar Schwabe)藥廠正式上市全球第一個銀杏葉標準提取物EGb761（ginkgo biloba extract），其質量指標為黃酮苷24%，萜內酯6%，銀杏酸10ppm，此標準為許多國家所公用。但國際上并沒有制定正式統一的標準，也沒有統一的含量測定方法，各廠商都有自己的質控指標，且不同的地區、不同的季節、不同的加工方法和不同的制劑工藝對銀杏葉中藥效成分影響很大。    資料表明銀杏葉含有多種

5、藥用活性成分，其有效成分主要是銀杏內酯和黃酮類(以槲皮素、山奈素、水楊梅素為主)1。近年來，生物類黃酮抗氧化活性倍受人們的重視，生物類黃酮是最強的抗氧化劑之一。且分子較小，水溶性強，易被機體吸收，無蓄積作用，能清除自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，抗細胞凋亡24；調節器官組織功能，有效延緩衰老5。已有研究發現EGb761能抑制巨噬細胞以及內皮細胞中iNOS基因表達6。本研究擬以LPS和PMA誘導體外培養的C6細胞為實驗模型，采用激光共聚焦、RTPCR、Western blot分析等技術研究EGb761對C6膠質瘤細胞NFB表達和NO生成的調控。    1

6、  材料和方法    1.1  材料  實驗試劑主要有：C6膠質瘤細胞系（中科院上海細胞生物學研究所）；DMEM培養基、胎牛血清（Hyclone公司）； UNIQ10柱式總RNA提取純化試劑盒（上海生工公司）；Access QuickTM RTPCR試劑盒（Promega公司）等；EGb761（法國Beaufour Ipsen 制藥公司MarieTherses DroyLefaix博士惠贈）。    實驗儀器有：CO2培養箱（Napco，USA）；紫外分光光度計（Beckman，USA）；電泳儀（EPS

7、301，USA）；PCR儀（Eppendorf，Germany）；凝膠成像系統（UVP，USA）；激光共聚焦掃描熒光顯微鏡（Olympus，Japan）等。    1.2  細胞培養  將復蘇的C6膠質瘤細胞混懸于DMEM培養基中（含10%滅活胎牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素），置37、含5%  CO2的細胞培養箱內培養，待細胞長成單層后（約3d）按14傳代。    1.3  細胞內NO水平檢測  將處于對數生長期的C6細胞用0.1%的胰酶消化，用含10%胎牛血清的

8、培養基重懸細胞，配成1×105的細胞懸液，接種于4cm培養皿中，每皿2ml，貼壁2h后換成無血清培養基，分為3組，即對照組、誘導組（LPS 1g/ml和PMA  400ng/ml）和藥物組（在加入LPS和PMA前2h加EGb761 50g/ml），12h后換成帶DAF2DA探針（2.5 mol/L）的培養基，培養1h，用培養基洗滌細胞3次，置顯微鏡下觀察，激發波長488nm。    1.4  亞硝酸鹽測定  細胞接種于24孔培養板，1×105/孔，分為對照組、誘導組和藥物組3組，對照組不加誘導劑和藥物，誘導組加入誘

9、導劑LPS（終濃度1g/ml）和PMA（終濃度400ng/ml），藥物組在加入誘導劑前2h先加入EGb761（終濃度50g/ml），取上清培養液加入等量Griess試劑，室溫放置10min，用Bekman DU640可見紫外分光光度計，在546nm處測定其吸光度A值，以亞硝酸鈉為標準，繪制標準曲線，求出亞硝酸鹽的含量，并換算成nmol/L×105個細胞。    1.5  RTPCR分析  分別提取各組總RNA，RTPCR試劑盒進行擴增以分析iNOS基因的mRNA表達，actin為內參物。PCR引物設計參照文獻7，由上海生工公司合成。引

10、物序列如下：iNOS：5AGA GAG ATC CGG TTC ACA3/ 5CAC AGA ACT GAG GGT ACA3， 擴增片段長度376bp；actin： 5TCC TTC GTT GCC GGT CCA CA3/5CGT CTC CGG AGT CCA TCA CA3，擴增片段長度509bp。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，UVP掃描分析。    1.6  蛋白質印跡分析  用細胞刮刀將各組細胞刮下，離心收集，加入細胞裂解液A(細胞膜裂解)，混勻后冰浴15min，13000g離心15min，上清作為胞漿蛋白提取物進行蛋白質印跡分析，用于分析iNOS基因的表達水平以及檢測IB的降解；沉淀用細胞裂解液A洗1次，混懸于細胞裂解液B(細胞核裂解)，混勻后20冷凍過夜，13000g離心15min，上清作為核蛋白提取物進行蛋白質印跡分析，用于分析NFB p65/Rel A亞基的轉運入核。    用Bradford法分別測定胞漿蛋白和核蛋白濃度。取胞漿蛋白40g、核蛋白20g，以8% SDSP