1、反相高效液相色譜法測定冬凌草中烏索酸和齊墩果酸的含量         【摘要】  目的建立反相高效液相色譜（RPHPLC）法測定冬凌草中烏索酸和齊墩果酸的含量。方法色譜柱為NUCLEODUR C18 RP柱(250 mm× 4.6 mm, 5 m)；流動相為甲醇水(8713)；流速0.8 ml·min-1，光電二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm，柱溫25 。結果在選定色譜條件下線性范圍良好，烏索酸和齊墩果酸的樣品加樣回收率分別為96.2%和98.7%，RSD為1.9%和0.9%。結

2、論該方法快速簡便，結果準確可靠。 【關鍵詞】  冬凌草； 烏索酸； 齊墩果酸； 反相高效液相色譜； 含量測定基金項目：國家“863”計劃重點資助項目Abstract：ObjectiveTo develop a quantitative method for determination of ursolic acid and oleanolic acid in Rabdosia rubescens by RPHPLC. MethodsHPLC was carried out on NUCLEODUR C18 RP column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at

3、25 using methanolwater (8713) as mobile phase with a flow rate of 0.8 ml·min-1 and detection wavelength was at 210 nm.  ResultsThe good linear relationship was obtained under the optimum conditions. The recoveries of the standards added for ursolic acid and oleanolic acid were 96.2 % and 9

4、8.7%, respectively, while the relative standard deviations were 1.9 % and 0.9%.ConclusionThe method is rapid and precise.Key words：Rabdosia rubescens;  Ursolic acid;  Oleanolic acid ;  RP-HPLC;  Content determination   冬凌草為唇形科香茶菜屬植物碎米亞Rabdosia rubescens (Hemsl.)Hara的干燥全

5、草，廣布于黃河、長江流域，主產地在河南濟源太行山一帶。冬凌草味甘、苦，性微寒，具清熱解毒，消炎止痛，健胃活血及抗腫瘤之功效1。用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷及食管癌、賁門癌、肝癌、乳腺癌等。臨床實驗證明冬凌草對食管癌、賁門癌、肝癌等有一定療效，對食管上皮增生有顯著療效2。1991年我國衛生部批準將其干燥葉及地上部分作為中藥材，收入部頒中藥材標準。冬凌草中的主要有效成分為冬凌草甲素、冬凌草乙素、烏索酸和齊墩果酸。近年藥理研究表明,不僅冬凌草甲乙素具有很強的抗癌作用,烏索酸和齊墩果酸也具有一定的抗腫瘤活性35。筆者采用反相高效液相色譜法同時測定了不同產地冬凌草中烏索酸和齊墩果酸的含量，為控制

6、藥材質量提供依據。1  儀器與材料   Waters高效液相色譜儀（515泵，2996光電二極管矩陣檢測器，7725I 進樣閥，Empower 中文色譜工作站），ROMB10D高純水機（杭州永潔達膜分離設備廠），CP225D分析天平（德國Sartorius公司），FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），20226A型數顯電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司），KS1500超聲提取儀器（寧波科盛儀器廠）。   甲醇為色譜純（色譜純，上海陸忠試劑廠），水為高純水，95%乙醇（分析純，江西同盟試劑化工廠），烏索酸和齊墩果酸對照品（

7、中國藥品生物制品檢定所提供，批號110742200314，110709200304，供含量測定用）。冬凌草(市售，購自樟樹藥材市場)，經本所生藥室鑒定為唇形科香茶菜屬植物碎米亞Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara的干燥葉和地上部分。2  方法與結果2.1  溶液的制備2.2   檢測波長的確定取烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液進樣，在190500 nm波長范圍進行光譜掃描，其在流動相中的最大吸收波長均為203.4 nm (圖1)，但由于流動相在短波長處有末端吸收，為了減少干擾，提高信噪比，提取不同波長的色譜圖進行比較，選擇210 n

8、m為檢測波長信噪比高，峰形好，基線平穩6。2.3  色譜條件色譜柱為NUCLEODUR C18 RP柱(4.6 mm×250 mm，5 m)；流動相為甲醇水（8713，V/V）；流速0.8 ml·min-1；檢測波長210 nm；柱溫25°C，進樣量10 l。烏索酸和齊墩果酸理論塔板數均大于10 000，分離度大于1.5。烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液及冬凌草樣品溶液的HPLC色譜見圖1。圖1  烏索酸和齊墩果酸對照品紫外光譜（略）2.4   線性關系實驗分別精密吸取對照品混合溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0

9、 l，按選定的色譜條件進樣并測定峰面積。以峰面積（V·s）對進樣量（g）進行線性回歸，烏索酸和齊墩果酸的回歸方程分別為            YUA=1.12×105X +3.68×103，r=0.999 6，   YOLA =1.35×105 X +2.11×103，r=0.999 5   表明當烏索酸進樣量在0.064 41.288 g，齊墩果酸進樣量在0.025 60.512 g時，線性關系良好。2.

10、5   儀器精密度實驗精密吸取烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液10 l進樣，重復5次，測得烏索酸峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.6 %（n=5），齊墩果酸的峰面積RSD為0.9 %（n=5），表明儀器精密度良好。2.6  方法重現性實驗精密稱取冬凌草樣品5份，按上述方法配制樣品溶液，精密吸取10 l進樣分析，測得烏索酸含量的RSD為1.6 %（n=5），齊墩果酸含量的RSD為2.2 %(n=5)，表明方法重現性好。2.7  加樣回收率實驗精密稱取已知烏索酸和齊墩果酸含量的冬凌草藥材6份，每組兩份，按高，中，低3種濃度分別加入適量烏索酸和齊墩果酸對照品，

11、制備樣品溶液，進樣分析，烏索酸和齊墩果酸平均加樣回收率分別為96.2 %和98.7 %，RSD為1.9%和0.9%。a.對照品  b.樣品  1-齊墩果酸  2-烏索酸圖2  對照品和樣品的HPLC譜圖（210 nm）（略）2.8  樣品中烏索酸和齊墩果酸含量測定精密稱取不同批次的冬凌草樣品約3 g，制備樣品溶液。精密吸取樣品溶液10 l，分別進樣，平行實驗3次，測定烏索酸和齊墩果酸峰面積，外標法計算平均含量。結果見表1。表1  樣品中烏索酸和齊墩果酸的測定結果（略）3  討論   測定結果表明，冬凌草中

12、烏索酸和齊墩果酸的含量較高，為三萜酸類主要成分，兩組份均具有抗腫瘤及抗炎抑菌等生物學效應，這與冬凌草抗炎、抗腫瘤的藥理活性相一致。   冬凌草葉中烏索酸和齊墩果酸的含量明顯高于地上部分，可能是由于莖的纖維含量高，質地相對致密，兩種三萜酸在莖中的含量相對較低所致。中草藥的藥效不僅取決于活性組份的種類和含量高低，其藥用部位也是決定因素之一。   建立的定量分析方法準確、快速，數據準確，重現性好，可用于冬凌草中烏索酸和齊墩果酸的含量測定。【參考文獻】  1 屈紅麗,可 鈺,尹 鵬，等.冬凌草中總黃酮提取工藝研究與含量測定J.時珍國醫國藥,2006,17(10)：1929.2 劉 凈,梁敬鈺,謝 韜.冬凌草研究進展J.海峽藥學,2004,16(2)：1.3 張俊峰，劉加軍，陸敏強，等.冬凌草甲素抑制人肝癌BEL7402細胞生長及誘導細胞凋亡的機制研究J.中草藥,2006,37(10)：