1、響應面分析法優選生精湯中淫羊藿苷的提取工藝研究        【摘要】  目的優選生精湯中淫羊藿苷提取的工藝條件。方法采用響應面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標進行實驗，考察料液比、乙醇濃度、提取時間等因素對提取工藝的影響。結果優選出醇提淫羊藿苷的最佳工藝為：加30倍量70乙醇，回流提取1.75 h，提取兩次。生精湯中淫羊藿苷的含量為1.36 g/g。結論該方法簡便易行，穩定性好，適于化生產中應用。 【關鍵詞】  響應面分析法； 淫羊藿苷； 提取工藝； Box-Benhnken中心組合實驗生精

2、湯由菟絲子、淫羊藿、熟地、補骨脂、女貞子等11味中藥組成。經動物實驗1證明生精湯能顯著降低模型大鼠血清雄激素含量，增加血清雌、孕激素含量促排卵。經多年臨床應用2證實的生精湯為中醫藥補腎活血法女性多囊卵巢綜合征的有效組方。淫羊藿為處方中的君藥，淫羊藿苷類黃酮化合物為其主要有效成分，此外含有生物堿、木脂素、多糖和微量元素等。藥理實驗研究表明3，4，淫羊藿總黃酮具有性激素樣作用，可以使雌性小鼠子宮增重、E2含量升高、雄性小鼠血清T含量升高。淫羊藿苷能延緩卵巢卵母細胞巢破裂，抑制原始卵泡的發育啟動，減少卵泡的消耗，使處于靜止期的原始卵泡數增多5。淫羊藿總黃酮為生精湯治療女性多囊卵巢綜合征的主要有效成分

3、之一。響應面分析法6以回歸方法作為函數估算的工具，將多因子試驗中因子與試驗結果的相互關系函數化，可研究因子與響應值之間、因子與因子之間的相互關系，并可進行優化。本文采用響應面分析法，以提取物淫羊藿苷含量為指標進行實驗，考察藥材的料液比、乙醇濃度、提取時間等因素對提取工藝的影響，優選淫羊藿苷的最佳提取工藝，以便提出更多的有效成分，提高治療效果。1  儀器與試藥1.1  儀器LC-10AD高效液相色譜儀（日本島津公司），CLASS-VP色譜工作站，GL-CQ-250S超聲波清洗機（上海杰理科技有限公司），AE-240天平(上海梅特勒一托利多儀器有限公司)。W一201B數顯恒溫水

4、浴鍋(上海申騰生物技術有限公司)，R-201旋轉蒸發器 (上海申勝生物技術有限公司)。1.2 材料與試劑生精湯中各藥材（菟絲子、淫羊藿、熟地、補骨脂、女貞子、山藥、雞血藤、劉寄奴、王不留行、制香附、生麥芽）購自浙江中醫藥大學飲片廠，并經浙江中醫藥大學姚振生教授鑒定。     淫羊藿苷對照品購自藥品生物制品檢定所，批號：110737-200312，乙腈、甲醇(供高效液相色譜測定用)為色譜純，超純水，其余為分析純。2   方法與結果2.1  淫羊藿苷的含量測定72.1.1  色譜條件色譜柱為phenomenex-Genmini-

5、C18(4.6 mm×150 mm)；流動相為甲醇水（5248）；流速1.0 ml·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30；檢測靈敏度0.02AUFS；進樣量20 l。2.1.2  對照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷對照品2 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含有0.24 mg淫羊藿苷的溶液，作為對照品溶液。2.1.3  供試品溶液的制備按處方取生精湯各味藥材，精密稱定，回流提取兩次，合并提取液，混勻，濃縮至100 ml，取1 ml用0.45 m微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。2.1.4  標準曲線的制備精密吸

6、取對照品溶液，倍半稀釋后，分別注入液相色譜儀，記錄淫羊藿苷峰的峰面積。以進樣濃度C(g/g)為橫坐標，峰面積A為縱坐標進行線性回歸，回歸方程為：A=2×106C+109 929，r=0.999 9。表明淫羊藿苷在4.80.15 g范圍內，線性關系良好。2.1.5 精密度實驗精密吸取濃度為0.2 g/l的對照品溶液，重復進樣5次，每次20 l，測定峰面積，RSD=0.28%，表明儀器精密度良好。2.1.6   加樣回收實驗取已知含量的生精膠囊樣品0.25 g，共5份，分別加入0.2 g/l的淫羊藿苷對照品10 l，其余同“2.1.3”供試品溶液的制備方法制備，按“2

7、.1.1”色譜條件進樣20 l，測定峰面積，并計算回收率，結果平均回收率為100.4%，RSD=2.5%，表明本方法具有較好的加樣回收率。1         2.2  淫羊藿苷提取工藝研究2.2.1  響應面分析法因素的選取及方案分析按照處方分別稱取生精湯各藥材，共20.4 g，根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理6，綜合單因素試驗的結果，選取料液比、提取時間、乙醇濃度3個因素，每個自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1編碼，以淫羊藿苷得率作為響應值（Y）。采用SAS9.1.3對實

8、驗結果進行回歸分析。試驗因素與水平見表1，實驗方案及結果見表2。表2  實驗因素與水平（略）表2  響應面實驗安排及結果（略）2.2.2  實驗結果分析采用SAS9.1.3軟件對表2中不同試驗條件下所得到的淫羊藿苷得率進行響應面回歸分析，得擬合方程：Y1=0.808 7 + 0.291 65 X1 + 0.044 25 X2+ 0.059 575 X3+ 0.021 2 X12- 0.172 6 X1X2 + 0.0377 X1X3- 0.093 6 X22 - 0.003 25 X2X3- 0.348 2 X32。表3  回歸方程顯著性及方差分析（略）

9、由表3可知，在置信區間95%時，方程線性相關系數R= 0.989 1。證明回歸方程真實、可靠，具有統計學意義，可用于替代實驗點對實驗結果進行分析。方程各自變量(Xn)方差分析表明，方程一次項、二次項和交互項對多糖提取得率具有顯著性影響，因此各因素與響應值之間不是簡單的一次關系。并進一步對回歸方程各項作顯著性檢驗。表4  回歸方程各項的顯著性檢驗分析（略）由表可知，液料比對淫羊藿苷提取得率具有顯著性影響，而提取時間、醇濃度則無顯著性影響。根據回歸分析結果作出相應曲面圖和等值線圖，見圖13。利用SAS軟件，進行分析，得淫羊藿苷的最佳提取工藝條件為：液料比29.71，提取時間1.78 h，

10、乙醇濃度71.8%，在此條件下淫羊藿苷的理論提取得率為1.14 g/g。結合實際操作方便和方差分析結果，確定最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%的乙醇提取1.75 h，共提取兩次。2.2.3   驗證性實驗按照最佳提取工藝進行實驗驗證，提取3次，測得淫羊藿苷的平均得率為1.36 g/g，RSD為3.51%。結果見表5。表明該工藝穩定可行，重復性好。表5  驗證性試驗結果（略）3   討論     本研究采用響應面分析法對淫羊藿苷提取工藝進行優化，并得到回歸方程。其最佳提取工藝條件為：加藥材30倍量的70%乙醇

11、提取兩次，每次1.75h，結果淫羊藿苷得率為1.36 g/g。    傳統的數理統計往往采用正交設計或均勻設計8，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式，從而無法找到整個區域上的因素的最佳組合和響應的最優值。響應面分析法是通過中心組合實驗研究幾種實驗因素間相互作用的一種回歸分析方法，具有周期短，實驗次數少，回歸方程精確度高等優點，并能從圖形方面分析尋求最優實驗考察因素。本實驗利用響應面分析法所得淫羊藿苷提取最佳工藝，具有操作方便、重復性好、提取效率高等優點，穩定可行。【】  1周 璐，章巧萍，徐孝平，等

12、生精湯對雄激素致無排卵模型大鼠卵巢功能及形態學的影響J浙江中醫藥大學學報，2006，30（6）：6212章巧萍淺談補腎活血法多囊卵巢綜合征J中醫藥信息雜志，2004，11(11)：10143黃 菊，羅麗莉，傅玉才，等淫羊藿甙對大鼠早期卵巢卵泡發育和卵母細胞凋亡影響的初步研究J醫學雜志，2007，17（5）：5234劉 娟，朱兆榮，汪江華，等淫羊藿、補骨脂及其復方提取液的性激素樣作用觀察J中國獸醫雜志，2003，39(6) ：33 5葉海涌，劉 健，樓宜嘉淫羊藿苷衍生物的制備及其雌激素樣作用研究J浙江大學學報(醫學版)，2005，34(2)：1316Carlson R·Designs f