1、泛素化蛋白檢測方法泛素化蛋白檢測方法蛋白質泛素化簡介蛋白質泛素化修飾過程在人體免疫系統調節過程中起到了關 鍵性的作用。與磷酸化修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種 可逆的共價修飾過程，它能夠調節被修飾蛋白的穩定性、功能活 性狀態以及細胞內定位等情況。泛素蛋白是一個由76個氨基酸殘基組成的非常保守的多肽， 它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反應催化下與細胞內靶蛋白上 的一個或多個賴氨酸殘基發生共價連接。泛素蛋白本身也含有7個賴氨酸殘基，因此它們之間也能夠經過這些位點互相連接，形 成多泛素蛋白鏈（polyubiquitin chain）。當前研究顯示，如果多 泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第48位賴

2、氨酸殘基相連，會介導靶蛋白進入蛋白酶體而被降解；如果與被修飾蛋白上其它位點，比 如第63位賴氨酸殘基相連，則靶蛋白能夠發揮信號通路功能而不 會被降解。與磷酸化修飾途徑一樣，泛素化修飾途徑也是可逆的，即能 夠經過去泛素化酶（DUB）將泛素蛋白修飾物去除掉。靶蛋白經 泛素化途徑修飾之后，連接在靶蛋白上的泛素蛋白單體或多聚體 能夠被各種泛素蛋白結合結構域（UBD）所識別和結合。人類蛋白質組中含有兩種 E1酶、50種E2酶、600種E3酶、90種DUB 酶和20種UBD,這說明泛素修飾途徑在細胞調控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修飾途徑中決定底物特異性的關鍵酶，它能夠分為兩大類，即含有 HECT

3、結構域的E3酶和其它含有 RING 結構域或 RING樣結構域（比如 U-box或PHD結構域）的 E3酶。 這兩種E3酶都在免疫調控過程中起到了關鍵性的作用。蛋白質泛素化的檢測方法研究蛋白質的泛素化首先需要明確的三個基本點：哪些蛋白 發生了泛素化；發生了泛素化的蛋白質，具體是哪個位點的賴氨 酸殘基發生了泛素化；進行定量。明確了上述幾點后，進一步需要弄清楚的是，我們感興趣的 泛素化蛋白，是如何發生泛素化的，影響這一泛素化過程的關鍵分子是什么？或者說這一過程中的E3酶是什么？然后需要研究的是，這一蛋白質發生泛素化之后能夠產生那些分子效應？對下游的信號通路有什么影響？研究上述內容的實驗方法和實驗流

4、程：方法 一 ： western blot and strip經過 WB檢測所有發生泛素化的蛋白條帶，拍照后，將膜strip。然后與特定蛋白的抗體和特定泛素化位點的抗體反應，顯色拍照。經過陽性條帶的對比來初步判斷某一特定蛋白的特定位點發生了泛素化。【具體實驗流程附后】方法二： western blot and immunoprecipitations經過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結合的蛋白分離出來。分離出來的蛋白再進行SDS電泳和western blot分析。【具體實驗流程附后】。這一方法能夠明確具體哪個蛋 白的哪個賴氨酸殘基發生了泛素化修飾。方法三：in vitro ubiquit

5、ination assay將要研究的目的基因轉染293細胞，使其大量表示。24h后提取并分離目的蛋白。在體外反應buffer中將我們要研究的蛋白 A （被泛素化的那個蛋白）與 UBE1, UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex , HA-ubiquitin 以及我們要研究的蛋白 B（引起蛋白A泛素化的蛋白），共同進行孵育。將孵育后的產物進行IP和WB分析。【具體實驗流程附后】。這一方法 能夠明確引起哪個蛋白是引起某蛋白發生泛素化修飾的E3連接酶。方法四：in vitro ubiquitin-binding assay將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因轉染 293細 胞，大量表示后提純。或者直接提取內源性蛋白。在體外與K63- or K48-linked ubiquitin chai