1、蛋白質組學蛋白質組學-雙向電泳雙向電泳(proteomics-2de) 化學與生命科學學院化學與生命科學學院one genome many proteomesone genome many proteomes卵卵 毛蚴毛蚴 母胞蚴母胞蚴 子胞蚴子胞蚴 成蟲成蟲 童蟲童蟲 尾蚴尾蚴 （人、牛、鼠等）（人、牛、鼠等）（釘螺）（釘螺）（釘螺）（釘螺）central dogmadnarna蛋白質蛋白質復制復制轉錄轉錄逆轉錄逆轉錄復制復制翻譯翻譯中心法則中心法則基因表達調控基因表達調控from genes to proteinssequence sequence databasesdatabaseswh

2、at could happen+ +gene expressiongene expressiondatabasesdatabaseswhat would happenprotein expressionprotein expressiondatabasesdatabases+ +what is happeningp蛋白質組蛋白質組(proteome)是澳大利亞學者是澳大利亞學者williamswilliams和和wilkinswilkins于于19941994年首先提出，源年首先提出，源于蛋白質（于蛋白質（proteinprotein）與基因組（）與基因組（genomegenome）兩個詞的雜

3、合兩個詞的雜合, ,意指意指proteins expressed by proteins expressed by a genomea genome，即，即“一個細胞或一個組織基因組一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質所表達的全部蛋白質”。 1. concept p在人類基因組計劃中大約有在人類基因組計劃中大約有30,000個基因被鑒個基因被鑒定出來。定出來。p一個基因一個基因= =平均平均4個左右的剪接變異體，約個左右的剪接變異體，約120,000或更多的獨立蛋白。或更多的獨立蛋白。p+ +翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質組比基翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質組比基因組復雜因組復雜10

4、倍以上。倍以上。 1. concept proteomicsproteomics 指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞或組織內科學，其目的是從整體的角度分析細胞或組織內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律。白質功能與細胞生命活動規律。 生物學問題生物學問題的提出的提出實驗模型實驗模型的設計的設計實驗組和對照組實驗組和對照組樣品的制備樣品的制備蛋白樣品的蛋白樣

5、品的ief和和page電泳分離電泳分離圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點蛋白點的切取的切取胰酶對脫色后蛋白質的消化胰酶對脫色后蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對質譜結果的生物信息學分析和比對新新蛋白質的發現蛋白質的發現其它實驗其它實驗的進一步的進一步驗證驗證蛋白信息的蛋白信息的初步獲得初步獲得2. 雙向電泳的實驗原理雙向電泳的實驗原理雙向電泳在第一向分離中蛋白質先按其等電點分雙向電泳在第一向分離中蛋白質先按其等電點分開（開（isoelectric point pi值）。值）。pi值就是使蛋白質值就是使蛋白質不帶

6、凈電荷，且在電場中不發生遷移的特定不帶凈電荷，且在電場中不發生遷移的特定ph值。值。這項將蛋白質按其等電點分離的技術稱為等電聚這項將蛋白質按其等電點分離的技術稱為等電聚焦（焦（ief）。）。2. 雙向電泳的實驗原理雙向電泳的實驗原理 雙向電泳的第二向電泳是在第一向垂直方向上進行sds-page分離。 +ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10+ph 3ph 7.5ph 10第一向：等電聚焦第一向：等電聚焦+ph 3ph 7.5ph10ph 3ph 7.5ph10chargesize第二向：第二向：sds-page電泳電泳pim.wt.2-d

7、 electrophoresisph 3ph 3ph 10ph 10intuitive spot detection wizard差別分析示意圖差別分析示意圖sample 1 asample 1 bsample 1 cpresent in (a) and (c) not (b)present only in (a)stronger in (b) than (a) or (c)first dimension ieffirst dimension iefsecond dimension sds-pagesecond dimension sds-pagegel staininggel stainin

8、gspot excisionspot excisionimaging and analysisimaging and analysis雙向電泳流程雙向電泳流程sample preparationsample preparationexcision / digestiondigestion protocolde-stain50mm ammonium bicarbonate / 50% acetonitrilereduce10mm dithiothreitol in 100mm ammonium bicarbonate, 30 minutesalkylate55mm iodoacetamide i

9、n 100mm ammonium bicarbonate, 20 minuteswash100mm ammontium bicarbonate（重碳酸銨）dehydrateacetonitrile（乙晴）digest6ng/ul trypsin in 50 mm ammonium bicarbonate (25ul) , 5 hours at 37c全自動蛋白切取儀全自動蛋白切取儀mass spectrometry5000750010000125001500002550751000255075100025507510002550751000255075100025507510050007500

10、1000012500controlcontrolcontroltreated15000treatedtreatedmaldi-tof-ms a road map to discovery肽指紋圖譜搜庫肽指紋圖譜搜庫699.01201.41703.82206.22708.63211.0mass (m/z)3.4e+40102030405060708090100% intensity4700 reflector spec #1 mcbp = 1410.7, 339481410.65641825.00521373.73511501.84351810.9426920.40441088.5128832.

11、32141426.65201611.76231414.6631952.39321279.58281071.49721839.02391467.7369936.39802110.0144804.29821619.83941224.57572712.36041886.96792369.15042562.1958a7435764092312061489mass (m/z)3.7e+40102030405060708090100% intensity4700 ms/ms precursor 1410.66 spec #1 mcbp = 1412.0, 367321411.0077159.1277175

12、.1519622.4453130.0943136.1073112.1078586.4028329.233087.0934400.2777744.5311242.1750825.6071311.21531225.9021157.1348896.6573568.3899382.26921127.82021040.7800485.3623637.49261364.9694239.1746728.501498.0860313.21871237.8772829.5554966.7054163.1270wpsgsawpgyfrb1 1 maerrvpftf ltspswepfr dwyhgsrlfd qs

13、fgmphipe dwykwpsgsa wpgyfrllps 61 esallpapgs pygralsels sgiseirqsa dswkvtldvn hfapeelvvk tkdniveitg 121 kheekqdehg fisrcftrky tlppgveata vrsslspdgm ltveaplpkp aiqsseitip 181 vtveakkeep akkc說明：說明：a顯示hsp27的肽指紋圖譜，其中匹配的肽段已標注肽段質量。b1-b4顯示hsp27其中一個肽段的串級肽序列圖譜，匹配序列以不同顏色顯示。c顯示hsp27的氨基酸序列，其中匹配的序列以下劃線標出。74.0444

14、.4814.81185.21555.61926.0mass (m/z)6.1e+40102030405060708090100% intensity4700 ms/ms precursor 1825.01 spec #1 mcbp = 1826.4, 609641825.453186.1114175.1493492.3630901.6712733.5328401.2718585.4269185.1383314.2096884.63101286.0193199.2284296.1950454.3038579.4175811.64361014.78761767.4326670.53361599.2

15、465136.10881127.9061288.1920405.2757924.7575540.4209787.56781415.11821021.79711268.0050llpsesallpapgspygrb274.0441.4808.81176.21543.61911.0mass (m/z)1.7e+40102030405060708090100% intensity4700 ms/ms precursor 1810.94 spec #1 mcbp = 1812.4, 173411811.3629419.3214175.1487402.2954197.1694112.10111769.4

16、6411767.3433159.1246918.6669445.3461110.0894328.2449548.39751005.7376129.1321427.3275813.6554901.6321221.1763677.5632592.43901168.9028330.25211566.22581367.04911468.08531664.31101765.3416988.7060100.0994422.3383762.5588877.3094229.17601265.9904vpftfltspswepfrb33. 蛋白質組學與疾病研究蛋白質組學與疾病研究 通過測定體液和組織的蛋白質組通

17、過測定體液和組織的蛋白質組,我們可以尋找特我們可以尋找特異疾病的生物標記異疾病的生物標記,即疾病特異性蛋白即疾病特異性蛋白(disease specific proteins, dsps)。 dsps水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點。用的靶點。疾病的蛋白質組研究疾病的蛋白質組研究怎樣利用蛋白質組學來開發藥物怎樣利用蛋白質組學來開發藥物?差異表達的蛋白差異表達的蛋白提取蛋白質提取蛋白質,進行進行結晶處理結晶處理用用x射線晶體衍射技射線晶體衍射技術揭示蛋白質

18、結構術揭示蛋白質結構設計能夠阻斷蛋白設計能夠阻斷蛋白質活性的藥物質活性的藥物為疾病的預后、診斷、預防和治療奠定基礎，最終目標為疾病的預后、診斷、預防和治療奠定基礎，最終目標是治療靶向藥物、合理設計藥物和早期是治療靶向藥物、合理設計藥物和早期“標記標記”的鑒定。的鑒定。proteomeproteomicsprotein進進 展展各國政府支持，國際著名研究和商業機構各國政府支持，國際著名研究和商業機構加盟：加盟：19961996年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白年澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質組研究中心（質組研究中心（australia proteome australia proteome an

19、alysis facilityanalysis facility，apafapaf） 美國國立癌癥研究院（美國國立癌癥研究院（ncinci）投資）投資1 0001 000萬萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質組數據庫。白質組數據庫。ncinci和和fdafda共同投資數百萬美元建立癌癥不共同投資數百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質組數據庫。同階段的蛋白質組數據庫。英國建立三個蛋白質組研究中心對已完成英國建立三個蛋白質組研究中心對已完成或即將完成全基因組測序的生物體進行蛋或即將完成全基因組測序的生物體進行蛋白質組研究。白質組研究。 celeracelera

20、公司投資上億美元獨自啟動了全公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定和分類匯總人類組織、細胞和體面鑒定和分類匯總人類組織、細胞和體液中的蛋白質及其異構體，構建新一代液中的蛋白質及其異構體，構建新一代的蛋白質表達數據庫的工作。的蛋白質表達數據庫的工作。 1997年召開了第一次國際年召開了第一次國際“蛋白質組學蛋白質組學”會會議議 1998年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白年在美國舊金山召開了第二屆國際蛋白質組學會議質組學會議 1999年年1月在英國倫敦舉行了應用蛋白質組月在英國倫敦舉行了應用蛋白質組會議會議 我國也于我國也于1998年啟動了蛋白質組學研究，年啟動了蛋白質組學研究，在中科院上海生物化學研

21、究所舉辦了兩次全在中科院上海生物化學研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質組學研討會國性的蛋白質組學研討會 2003成立了中國人類蛋白質組組織成立了中國人類蛋白質組組織（chhupo），并分別于），并分別于2003年年9月、月、2004年年8月以及月以及2005年年8月召開了中國蛋月召開了中國蛋白質組學首屆、第二屆及第三屆學術大會，白質組學首屆、第二屆及第三屆學術大會，2004年年10月在中國北京召開了第三屆國際月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質組學會議。蛋白質組學會議。 n 科技部已將疾病蛋白質組研究列入我國科技部已將疾病蛋白質組研究列入我國“973”計劃項目和計劃項目和“863”計劃項目計劃項目；

22、國家自然科學基國家自然科學基金委員會也將金委員會也將“蛋白質組研究蛋白質組研究”列為重點項目。列為重點項目。n我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質組我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質組研究方面取得了較大的進展研究方面取得了較大的進展。central dogmanormal geneexpressionmrna經翻譯產生蛋白質，一個細胞在特定生理或病理狀態下表達的所有種類的蛋白質稱為蛋白質組(proteome) 蛋白質是基因功能的實施者，因此對蛋白質結構，定位和蛋白質-蛋白質相互作用的研究將為闡明生命現象的本質提供直接的基礎。表達蛋白質組(expressional)側重于研究一個細胞或組織

23、中所有蛋白質的表達狀況，包括表達參考圖譜的構建、蛋白質鑒定與數據庫構建、蛋白質翻譯后修飾和蛋白復合物結構的測定、以及不同生理或病理條件下蛋白質的比較分析等proteomicsgenomicstranscriptomicssystems biologybioinformaticsstatisticsintegrated view of the complex biological systemsgel stainingfirst dimension iefsecond dimension sds-pageimaging and analysisspot excisionsample prepar

24、ation3. proteomics experimental workflow蛋白質分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及側鏈的游離基團而成為帶電顆粒，并可在電場內移動，其移動方向取決于蛋白質分子所帶靜電荷。不同蛋白質分子根據其氨基酸組成及所在溶液的ph值，攜帶的靜電荷不盡相同，致使它們在電場中的遷移率各異，從而達到分理的目的。（two-dimensional electrophoresis，2-de） 將基因體或是由所取得的檢體利用蛋白質體技術將其展現出來,可以對此生物功能獲得較全面性資訊.當人類得到某種感染性疾病時,利用被感染者的血液或病變細胞當作檢體,以蛋白質體方法分析與控制組間之差異

25、性蛋白,篩選感染性微生物之標的蛋白質,利用這些標的蛋白質探討其感染及代謝途徑或是制造出診斷性抗體,相信這將成為研究感染性疾病的新標準模式. 1-11-1診斷標記診斷標記 蛋白質組學可以用來分析體液中特殊的蛋白,來解說在疾病診斷上的影響,有助於對疾病成因的了解,病程的控制與研究判斷預后的結果 .1-2 疾病診斷疾病診斷p患有腦膜炎或是頭部外傷的患者,可以取其脊髓液,透過雙向電泳技術來鑒定蛋白質型態 p患有呼吸窘迫的病人,因其胸腔充滿液體而壓迫到氣管,可經由胸腔穿刺吸出該液體後便可減輕患者的癥狀,再利用雙向電泳技術分析體液的成分 p患有快速癡呆癥者,已在其脊髓液中,檢驗發現兩種不正常的蛋白 (命名

26、為 130 和 131),最近被確定為 tau g chain,此為臨床上 cjd 所特有的病征. 蛋白質體學的研究也可以幫助我們去尋找新的疾病指標,相信在不久的將來將有助於監測疾病的進程,更進一步有助於疾病的治療 1-3 新的疾病指標新的疾病指標p 擴大性心肌病變(dilated cardiomyopathy, dcm )是一種嚴重的心臟疾病,也是現代繁 忙的都市人經常易患的疾病,最后將導致心臟失去功能;病人通常都只能期待換心以維持生命.p 運用蛋白質體的方法已經鑒定出心肌中150種蛋白質,比較后發現有25個蛋白質有明顯的差異;經由這些已確認的蛋白質資料庫與病人(或高危險群)的蛋白質做比對,

27、或許可以在疾病產生初期達到早期預防的目的.心血管疾病心血管疾病 肺癌是最具腫瘤性 (oncological) 的疾病之一.臨床上肺癌的診斷往往已屬晚期.直至目前為止,并無有效的治療方案可得.所以任何有助於肺癌診斷或預後的發展都是有助於肺癌的治療方針的. 因此,許多科學家致力于以雙向電泳技術研究肺癌.在分析組織病理學上不同種類的肺癌細胞時,結果發現不同組織病理類型細胞體會有不同的蛋白質表現圖譜. 另外,發現有一種專一性的蛋白質僅會出現在原發性肺腺癌上.例用此技術將可有效地鑒定出新的腫瘤標志 (tumor marker),在鑒別診斷麟狀上皮細胞肺癌與腺癌時有相當大的助益. 肺癌肺癌p 人類的腎臟癌是較少見的癌癥,其中源自於近端腎小管上皮細胞的腎細胞癌大約占成人惡性腫瘤的3 %.但如同許多實質性腫瘤般,腎細胞癌發現時期均屬癌癥末期,外科手術已難治愈的階段.并且無適當的腫瘤標志可參考.p 科學家在用雙向電泳技術研究腎臟癌組織的研究中發現有四種蛋白質的表現在腎癌細胞中會消失. p 雖然該研究沒有發現特定的標志蛋白質.但尚有許多可能與該癌癥發生相關的蛋白質仍待被鑒定.腎臟癌腎臟癌在比較人類正常乳房組織與惡性乳房癌的蛋白質分布中,發現兩者之間有專一性的蛋白質差異存在.在腫瘤細胞中,至少有 22 種蛋白質會不正常的增加,一種蛋白質則會減少.另外也發現到某些特定的蛋白質的表現與 estroge