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文檔簡介

1、rt-pcr三部曲rnarna提取提取逆轉錄為cdnapcrpcrrna提取-第一步提取rna器械的處理n玻璃、不銹鋼器皿：180度干烤46小時 （不離人）n塑料制品：-高壓滅菌，烘干-depc水浸泡過夜，撈出瀝干水分（很重要），烘干-電泳槽可用0.5m的naoh浸泡20min rna提取所需試劑和器皿清單干烤的物品：干烤的物品：n玻璃器皿：10002000ml的大燒杯（浸泡tip）、100ml的量筒（配乙醇用）、帶玻璃塞子的玻璃瓶3個（裝異丙醇、氯仿、75%的乙醇）n鋁飯盒（放et管）、鑷子（夾tip和ep管用）處理的塑料制品：處理的塑料制品：n槍頭（1000ul/200ul/20ul）ne

2、p管（1.5ml、200ul）nep管盒子（要與槍頭配套）制劑：ndepc、trizoln異丙醇、氯仿、乙醇(未開封的)n電泳緩沖液、瓊脂糖、ebdepc（焦碳酸二乙酯）ndepc水，na：配制好未消毒；蒸餾水中加入0.1%depc，室溫攪拌4小時以上至完全溶解。n作用：處理rna提取的器材（不能干烤的物品） 浸泡過夜nb:配制好已消毒。高壓滅菌20分鐘，冷卻備用。（通過高壓消毒，該物質會降解，從而無毒）n作用:配置75%乙醇，溶解rna防止rna降解n有專門的rna提取區域：避免人員流動n實驗人員帶口罩、帽子，勤換手套n快速操作n保證低溫環境：降低環境溫度、冰上操作（冰盒）、低溫離心1 rn

3、ase是一種蛋白酶，能夠降解rna。2 皮膚、唾液3 這個酶高效穩定。要么在depc水中處理n小時，要么在160度高溫烘烤6小時。此酶才會失效。 什么是rna酶rnase?n1 1mltrizol/孔，室溫放置5min，用吸管吹打吸取到ep管中；2 加200ul氯仿 劇烈振蕩15s，室溫放置23min；3 12000g 低溫離心 15min;4 小心取上層水相,一般400-450ul就足夠了（千萬不要貪多）！n5 加入500ul異丙醇 搖勻（反復顛倒10次），室溫放置10min； 6 12000g 低溫離心 10min；7 75乙醇 1ml 洗滌沉淀；8 7500g 離心 5min；（也可加大離心速度，這樣rna不易被倒掉）9 小心棄去乙醇（不要把rna倒掉），用小tip吸干凈殘余的乙醇（底部不要吸的太干， 室溫干燥510min；n10 加2030ul depc水溶解沉淀。n留取6ul，其余立即分裝兩份凍存（-80度）n2ul用于定量，余下用于跑膠電泳-判斷rna完整性和是否有dna污染n新鮮配置的電泳緩沖液n電泳時間不要太久，100120v，1015

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