1、基 因 工 程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建c pcr法b cdna法a 鳥槍法d 化學(xué)合成法e 基因文庫的構(gòu)建目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 基因工程或dna重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。n 一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：n 一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從

2、基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；n 另一類是利用pcr擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。a 鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進(jìn)鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組dna片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體dna的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開， 大小不可控 部分酶切： 片段長度可控

3、，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立） 鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體dna，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重

4、組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體dna 鳥槍法操作的改進(jìn)例如，已知某目的基因位于1.8 kb的sali片段中，將染色體dna用sali切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收dna片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將dna片段進(jìn)行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鳥槍法操作的改進(jìn)凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠dna片段回收技術(shù) 鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)b cdna法法 cdna法克隆

5、目的基因的基本戰(zhàn)略cdna法分離目的基因的基本程序cdna法法克隆目的基因的局限性cdna基因克隆基因克隆 cdnacdna文庫是指得到文庫是指得到足夠多足夠多的的分別分別克隆的克隆的cdnacdna片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種種mrnamrna的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cdnacdna文庫。文庫。 cdna librariescdna librariesmrna isolation, purificationcheck therna

6、integrity fractionate and enrich mrna synthesis of cdna treatment of cdna ends ligation to vectorcdna文庫文庫1. 1. 沒有原核生物的沒有原核生物的cdna cdna 文庫文庫 原核生物的原核生物的 mrna mrna 非常不穩(wěn)定；非常不穩(wěn)定； 原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。能包含所有基因的序列。2.2.cdna cdna 文庫對于真核生物的基因分析文庫對于真核生物的基因分析 cdnacdna文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫文庫是只含有

7、編碼蛋白的基因文庫 cdnas cdnas 沒有內(nèi)含子沒有內(nèi)含子 基因可以在基因可以在e. colie. coli 中直接表達(dá)中直接表達(dá) 用于新基因的鑒別用于新基因的鑒別 組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）cdna 文庫文庫cdna cdna 文庫文庫- -mrna mrna 分離分離 大部分真核生物的 mrnas 有 3 poly（ a ）尾巴 oligo (dt) 能與poly(a) 尾巴互補(bǔ)，由此來獲得mrna.aaaaaaaaaan5 cap5 cap1. 1. 傳統(tǒng)的分離方法是用oligo (dt)-纖維素柱分離總rna2.2. 把oligo(d

8、t) -磁珠同總rna混合，在強(qiáng)磁場下分離mrna3.3.用蔗糖梯度離心mrna核糖體復(fù)合體（溶解細(xì)胞）來分離mrna三種三種分離mrna的方法用纖維素純化poly(a)mrna的流程圖確定確定 mrna mrna 沒被降解沒被降解 方法:mrnamrna的翻譯的翻譯 : 用體外蛋白質(zhì)合成檢測mrnas 。（麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系或兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系） 通過凝膠電泳分析通過凝膠電泳分析mrnas mrnas : 用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cdna cdna 文庫文庫- - 檢測檢測mrnamrna的完整性的完整性克隆特殊的克隆特殊的 mrnasmrnas克隆一個(gè)特殊的基因比建立完整的cdn

9、a文庫更有用凝膠分離凝膠分離: : 通過瓊脂糖凝膠電泳回收 mrnasmrnas（根據(jù)（根據(jù)mrnamrna的大小）的大小） 富集富集: : 通過雜交來實(shí)現(xiàn)cdnacdna 的合成的合成: :第一鏈第一鏈 的合成的合成: : mrna, mrna, 反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄酶，oligo(dt) oligo(dt) ， 核酸末端轉(zhuǎn)移酶，核酸末端轉(zhuǎn)移酶，dntpsdntps 1. oligo(dt) 1. oligo(dt) 引導(dǎo)的引導(dǎo)的cdnacdna合成法合成法 2. 2. 隨機(jī)引物隨機(jī)引物引導(dǎo)的引導(dǎo)的cdnacdna合成法合成法第二鏈的合成第二鏈的合成: : 根據(jù)在第一鏈3-3-末端加尾末端加尾

10、（c c），用補(bǔ)充引物合成第二鏈），用補(bǔ)充引物合成第二鏈 cdna法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mdnacdna第一鏈的合成 5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 35ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 55ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5cdna第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dntpscdna第二鏈的合成 煮沸naoh自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cdna 5端會(huì)有幾對堿基缺失aaaaaaaaaaaaaa5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5tttt

11、ttttttttttp 5ttttttttttttttp 5aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttoh 3klenowdntpss1cdna第二鏈的合成 dnapol dntpsrnaesh置換合成法：獲得的雙鏈cdna 5端也會(huì)有幾對堿基缺失5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaoh 3ttttttttttttttp 5aaaaaaaaaaaaaap 55s1 aaaatttoh 3ttttttttttttttp 55ttttttttttttttoh 3aaaaaaaaaaaaaa 55tttttttttttttt 33t4-dna ligasecdna第二

12、鏈的合成 dctptdt引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cdna 能保留完整的5端序列5ppp5g g aaaaaoh 3tttttp 53 ho5ppp5g g aaaaacccccccoh 33 hoccccccctttttp 53 hoccccccctttttp 53 hoccccccctttttp 55 pggggggg3 hoccccccctttttp 55 pgggggggaaaaaoh 3naoh退火klenowdntpscdna法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cdna的克隆 雙鏈平頭的cdna通常可以使用下列三種方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接

13、同聚物尾，最好是at同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和s1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 cdna法分離目的基因的基本程序完備分離程序 提取細(xì)胞總mrna，合成總cdna，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子 篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于mrna分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子viii基因等 cdna法分離目的基因的基本程序特異分離程序 提取細(xì)胞總mrna，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mrna，由此合成雙鏈cdna，

14、然后進(jìn)行克隆 特異分離程序較適用于mrna豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 cdna法分離目的基因的基本程序差異分離程序 利用兩組細(xì)胞mrna種類的差異，分離克隆差異mrna所對應(yīng)的cdna，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠fr3t3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能 差異分離程序 多瘤病毒感染的fr3t3細(xì)胞正常的fr3t3細(xì)胞總mrna總mrnacdna雙鏈cdna單鏈cdna提取mrna合成cdna合成第二鏈克隆提取mrna共價(jià)交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因cdna克隆cd

15、nacdna克隆的優(yōu)越性克隆的優(yōu)越性 1. 1. 以以mrnamrna為材料；為材料； （一些（一些rnarna病毒，不經(jīng)過病毒，不經(jīng)過dnadna中間體，對其研中間體，對其研 究，究，cdnacdna是唯一可行的方法）是唯一可行的方法） 2. 2. 基因文庫的篩選比較簡單易行；基因文庫的篩選比較簡單易行； 3. 3. 由于每一個(gè)由于每一個(gè)cdnacdna克隆都含有一種克隆都含有一種mrnamrna序列，序列， 在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低； 4. 4. 克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測定，克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測定， 和發(fā)育過程中或組

16、織中基因特異表達(dá)和發(fā)育過程中或組織中基因特異表達(dá) cdna法克隆目的基因的局限性并非所有的mrna分子都具有polya結(jié)構(gòu) 細(xì)菌或原核生物的mrna半衰期很短mrna在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 c pcr法目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 pcr（polymerase chain reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或pcr擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外dna聚合程序 使用pcr法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或dna片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必 需的雙引物 pcr法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理55目的基因5變性加熱55

17、引物退火55底物聚合5555加熱變性5555555555555555555555555退火 引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123 由taq dna聚合酶擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物中，其3末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是a，因?yàn)閠aq dna聚合酶對datp具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取tdt末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的t載體克隆 pcr克隆目的基因的基本程序55aatt55pcr擴(kuò)增產(chǎn)物t 載體t7lacz mcsoriaprd 化學(xué)合成法目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略化學(xué)合成的單元操作dna化學(xué)合成的用

18、途化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的dna序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法： 混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈dna小片段t4-dna連接酶連接克隆入合適的載體 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補(bǔ)釘延長法： 混合退火根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈dna小片段以及20-30堿基長的單鏈dna中片段t4-dna連接酶連接克隆入合適的載體 klenow酶聚合化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成大片段酶促法： 混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈dna片段t4-dna連接酶連接克隆入合適的載體 kl

19、enow酶聚合化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成 上述三種方法各有利弊： 化學(xué)合成dna的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高； 在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個(gè)堿基長的dna單鏈大片段的總收率只有7.7%化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸氨基酸序列，而基因序列未知，此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的dna序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cdna法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由

20、于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在17-20個(gè)核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列cys met asp glu met lys arg asn ile所有可能的dna序列tgtatggacgaaatgaaaagaaacata c t gatg g g t t c cga cgg cgt cgc設(shè)計(jì)的簡并探針序列tgtatggacgaiatgatgtatggatgaiatgatgcatggacgaiatgatgcatggatgai

21、atga a g此外還可以參考各種生物體的est數(shù)據(jù)庫進(jìn)行傾向性簡并序列設(shè)計(jì)expressed sequence tag化學(xué)合成的單元操作 化學(xué)合成dna的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。 從反應(yīng)機(jī)理上來講，dna化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，dna合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的化學(xué)合成的單元操作ohghhhhoch2odmtpomenchmemechmemeoh

22、ghhhhoch2odmtpomenchmemechmemehdmt： 二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂dna化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因 制備探針、引物、接頭 如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 基因等e 基因文庫的構(gòu)建目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建基因文庫的基本概念基因文庫的構(gòu)建程序基因組文庫重組克隆的排序基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建 基因文庫（基因文庫（gene librarygene library）：）：用重組dna技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總dna或染色體dna的所有片段隨機(jī)地連接

23、在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于線粒體或葉綠體的基因文庫。由于制備片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的片段即可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近順序。 基因文庫的構(gòu)建就是利用所謂的基因文庫的構(gòu)建就是利用所謂的“鳥搶法鳥搶法”，使基因組的使基因組的dnadna片段隨機(jī)地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，片段隨機(jī)地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的。引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的。基因文庫的基本概念基

24、因庫與基因文庫基因庫（gene pool） 特定生物體全基因組的集合（天然存在） 基因文庫（gene library or gene bank） 從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因） 存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為： cdna文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因） 基因文庫的基本概念基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體dna用cdna法構(gòu)建cdna文庫，材料來自mrna在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mrna種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cdna文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝

25、組織cdna文庫或胚胎組織cdna文庫等。很顯然， cdna文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫 eukaryotes prokaryotes與載體連接 構(gòu)建基因文庫的基因組構(gòu)建基因文庫的基因組dnadna必須進(jìn)行純化后，必須進(jìn)行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機(jī)片斷才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機(jī)片斷基因組基因組 dnadna的純化的純化 : 原核生物:直接從細(xì)胞中體取基因組dna去除蛋白（蛋白酶消化）去除蛋白（蛋白酶消化）, , 脂類和其它脂類和其它“雜質(zhì)雜質(zhì)”。真核生物真核生物 : :從細(xì)胞核中從細(xì)胞核中基因文庫的構(gòu)建程序基因組dna的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程

26、中的完整性， 用于基因組文庫構(gòu)建的dna在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的dna分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的dna片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高aaaa用常規(guī)方法制備的染色體dna的長度一般在100 kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有sds、蛋白酶k、rnase的緩沖液中浸泡，可獲得1000 kb大小的dna片段基因文庫的構(gòu)建程序基因組dna的切割 用于基因組文庫構(gòu)建的dna片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是： 第一，保證dna片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證dna片段大小均一超聲波處理后的dna片段呈

27、平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶，如：sau3ai或mboi等，這樣dna酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的dna片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的dna片段隨機(jī)連為一體！ 用于構(gòu)建基因文庫片段的產(chǎn)生大致有兩種方法：用于構(gòu)建基因文庫片段的產(chǎn)生大致有兩種方法： 一、限制性內(nèi)切酶完全消化基因組dna這個(gè)方法有兩個(gè)特點(diǎn)：這個(gè)方法有兩個(gè)特點(diǎn)： 1、假如所需的基因含有所用限制酶的識別位點(diǎn)，那么這一基因?qū)⒈豢思偃缢璧幕蚝兴孟拗泼傅淖R別位點(diǎn)，那么這一基因?qū)⒈豢寺≡趦蓚€(gè)或數(shù)個(gè)片段中，給研究帶來一定的困難。隆在兩個(gè)或數(shù)個(gè)片段中，給研究帶來一

28、定的困難。 2、一般常用的限制酶大多識別六個(gè)一般常用的限制酶大多識別六個(gè)bpbp序列，切割序列，切割dnadna所產(chǎn)生的片段的所產(chǎn)生的片段的平均大小相對比較小（約平均大小相對比較小（約4kb4kb即即4 46 64096bp4096bp），因此整個(gè)基因文庫要含），因此整個(gè)基因文庫要含有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進(jìn)行篩選就十分費(fèi)事費(fèi)時(shí)。有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進(jìn)行篩選就十分費(fèi)事費(fèi)時(shí)。雖然可以用限制雖然可以用限制酶進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生約酶進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生約20kb20kb的片段，但這種方法必的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。須掌握好酶解的條件。 hae 、 alu 二

29、、機(jī)械隨機(jī)切割二、機(jī)械隨機(jī)切割 這種方法可以制備大片段的這種方法可以制備大片段的dnadna（用噬菌體（用噬菌體作載體約作載體約20kb20kb，以，以cosmidcosmid作載體約作載體約45kb 45kb ），從而克服上述的兩處缺點(diǎn)。但），從而克服上述的兩處缺點(diǎn)。但是這種方法的不是之處是：所制備的片段的末端順序是隨機(jī)的是這種方法的不是之處是：所制備的片段的末端順序是隨機(jī)的，還必須經(jīng)過末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體，還必須經(jīng)過末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體進(jìn)行連接。進(jìn)行連接。 用于基因文庫構(gòu)建的載體常用噬菌體用于基因文庫構(gòu)建的載體常用噬菌體或或cosmidcosmid載體，

30、因?yàn)樗d體，因?yàn)樗鼈兊娜萘勘容^大，可克隆大片段們的容量比較大，可克隆大片段的的dnadna。雖然。雖然cosmidcosmid載體比載體比載體的容量大，但由于文庫的保存（載體的容量大，但由于文庫的保存（cosmidcosmid載體在載體在e.colie.coli中，中， 載體在噬菌體中）載體在噬菌體中） 比比cosmidcosmid容易容易，因此，因此載體用的更多些載體用的更多些。文庫的大小文庫的大小 ( (確定有足夠的克隆數(shù)確定有足夠的克隆數(shù)) ) 必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任何堿基序列。何堿基序列。計(jì)算重組子數(shù)量的公式：計(jì)算重

31、組子數(shù)量的公式：n = ln (1-p) ln (1-f) p: p: 重組體群體中出現(xiàn)目的基因的序列的幾率（一般期望重組體群體中出現(xiàn)目的基因的序列的幾率（一般期望99% 99% ） f : f : 限制片斷的平均大小與基因組限制片斷的平均大小與基因組dnadna總量之比總量之比 nn：一個(gè)完整基因文庫所應(yīng)包含的重組：一個(gè)完整基因文庫所應(yīng)包含的重組dnadna的轉(zhuǎn)化子的克隆數(shù)的轉(zhuǎn)化子的克隆數(shù)基因文庫的基本概念基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)n之間的關(guān)系可用下式表示：n = ln ( 1 p ) / ln ( 1 f )其中：

32、 p = 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體dna總長為2.9 x 109 bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15 kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個(gè)克隆；而當(dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫至少需要180萬個(gè)克隆for example : 期望值為0.99，插入片斷為20kb20kb的的 e.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因組的克隆數(shù)的計(jì)算n e.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)nhuman=

33、 = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 這個(gè)例子說明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb ）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個(gè)克隆；而真核生物則需要更大承載能力的載體。 有一些序列不能被克隆example: 1. 序列缺乏酶切位點(diǎn); 2.目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承載能力的dna片斷上 too long for the vector used基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆克隆與克隆

34、之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-dna或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用yac或bac載體l-dna 由于絕大多數(shù)真核生物的mrna小于10 kb，因此用于cdna文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒 上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)粒考斯質(zhì)粒15 kb25 kb45 kbbac300 kbyac400 kb 用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因 大型基因

35、組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個(gè)重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟基因文庫的構(gòu)建程序從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆基因文庫的構(gòu)建程序基因文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源dna片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 將待連接的dna片段根據(jù)載體的裝載量分級分離用堿性磷酸單酯酶除去dna片段的末端磷酸基團(tuán) 用tdt酶在dna片段

36、的末端上增補(bǔ)同聚尾末端 基因組文庫重組克隆的排序 大型基因文庫（包括人的基因文庫）的構(gòu)建在技術(shù)上并不十分困難，如果一個(gè)yac基因文庫的插入片段總和為整個(gè)基因組的十倍以上時(shí)，一般就能從基因文庫中調(diào)出任何一段dna序列。然而基因文庫的克隆都是隨機(jī)序列，必須將所有的克隆排列成一個(gè)像天然染色體dna上所表現(xiàn)出的信息順序。這項(xiàng)工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作基因組文庫重組克隆的排序 將單一的yac克隆插入dna片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素 然后再用sau3ai或mboi將末端標(biāo)記的dna片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個(gè)yac克隆走在

37、同一塊板上，形成10個(gè)克隆的特征性dna指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆dna的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè)yac片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè)yac克隆的dna片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標(biāo)記法酶切片段末端標(biāo)記法hhhhs s sssssssssssss ssss單一克隆指紋圖譜十克隆指紋圖譜載體dna克隆dna基因組文庫重組克隆的排序 將若干yac克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的 用20種探針隨機(jī)定位雜交（一對一）20份yac克隆薄膜 如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互

38、重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述yac克隆的排列順序 隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法0102030405060708091011121314151617181920a b cd e fg01 02 03 04 0506 07 08 09 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20dabcefg11111111111111111111111111111101 04 12 06 1314 02 14 07 19 1115 05 08 16 03 10 09 20 18dabcefg11111111111111111111111111

39、1111fcadgeb基因組文庫重組克隆的排序 從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5 - 2.0 kb范圍內(nèi) 分別以上述亞克隆dna片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入dna片段必定與起點(diǎn)克隆所含的dna片段連鎖在一起 然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體dna的端點(diǎn) 染色體走讀法（chromosome walking）染色體走讀法（chromosome walking）走讀的起點(diǎn)克隆片段亞克隆旁測序列探針標(biāo)記第一輪雜交陽性克隆陽性克隆第二輪雜交第二輪雜交染色體走讀法（chromosome wal

40、king）走讀的起點(diǎn)克隆片段克隆基因的分離與篩選克隆基因的分離與篩選 1.應(yīng)用核酸探針 2.應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法 3.應(yīng)用mrna差別顯示技術(shù) 4.應(yīng)用表達(dá)文庫 5.酵母雙雜交體系 步驟：步驟： 1. 1.獲得探針獲得探針2.2.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜3.3.雜交雜交transfer the dna in the plaque or colony to anylon or nitrocellulose membranephage dna bind to the membrane directly bacterial colonies must be lysed to release dna on the

41、 membrane surface. hybridization (in a solution containing nucleic acid probe)wash to remove unhybri-dization probe and visualize x-ray film(radio-actively labeled ) antibody or enzyme(modified nucleotide labeled line up the hybridizated region orrepeated hybridization (alkali treatment)探針的來源探針的來源 1

42、. 1. 某種生物實(shí)驗(yàn)體系中分離到的基因序列，可作為某種生物實(shí)驗(yàn)體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中從其它生物中分離相關(guān)基因分離相關(guān)基因的核酸探針。的核酸探針。 2.2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。 功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），酸序列的區(qū)段（保守區(qū)）， 往往由彼此相鄰的往往由彼此相鄰的6767個(gè)氨基酸組成。個(gè)氨基酸組成。 寡核苷酸探針的人工合成寡核苷酸探針的人工合成 1. 探針的長度探針的長度: 要使探針與目的基因序列嚴(yán)格互補(bǔ)，最少的探針長度要使探針與目的基因序列嚴(yán)

43、格互補(bǔ)，最少的探針長度1516個(gè)核苷酸，實(shí)驗(yàn)中為保證足夠的特異性，通常使用個(gè)核苷酸，實(shí)驗(yàn)中為保證足夠的特異性，通常使用1720個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 2. 簡并性簡并性: 根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的。因完全互補(bǔ)的。 由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的，其它由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的，其它的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。 1. 1.猜測體探

44、針猜測體探針 2.pcr-2.pcr-猜測體探針猜測體探針應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法 分離克隆的目的基因分離克隆的目的基因差別雜交差別雜交（differential hybridizationdifferential hybridization） 又稱差別篩選又稱差別篩選 (differential screening )(differential screening ) 適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mrnamrna的的cdnacdna。 扣除雜交扣除雜交（subtractive hybridization subtractive

45、hybridization ）又叫扣除又叫扣除cdnacdna克隆（克隆（ subtractive cdna cloningsubtractive cdna cloning） 通過構(gòu)建扣除文庫得以實(shí)現(xiàn)。通過構(gòu)建扣除文庫得以實(shí)現(xiàn)。差別雜交：差別雜交： 需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mrnamrna提取物，以兩種總提取物，以兩種總mrnamrna探針平行雜交，對有表探針平行雜交，對有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總達(dá)目的基因的細(xì)胞總mrnamrna構(gòu)建的克隆文庫進(jìn)行構(gòu)建的克隆文庫進(jìn)行篩選。

46、篩選。差別雜交的局限性：差別雜交的局限性： 1. 1.雜交靈敏度低，對于低峰度的雜交靈敏度低，對于低峰度的mrnamrna尤為明顯尤為明顯 2.2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的dnadna保有保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號不一致。量有差別，導(dǎo)致雜交信號不一致。 扣除雜交：扣除雜交： 去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cdnacdna序列，從而使欲分離的目的基因的序列得序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。到有效的富集。應(yīng)用應(yīng)用mrnamrna差別顯示技術(shù)（差別顯示技術(shù)（ddrt-pcrddrt-pcr

47、） 分離克隆的目的基因分離克隆的目的基因 (differential display reverse transcription polymerase chain reaction)原理原理： 用用3 -3 -端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cdnacdna的第的第一鏈；用一鏈；用3 -3 -端錨定引物和端錨定引物和5-5-端端10-mer10-mer隨機(jī)引隨機(jī)引物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行pcrpcr擴(kuò)增（擴(kuò)增（ddrt-pcrddrt-pcr），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2323小時(shí)，可顯示出小時(shí)，可顯示出5

48、010050100條長度在條長度在1005000bp1005000bp之間的之間的dnadna條帶。條帶。3 -3 -錨定引物：錨定引物： p.liangp.liang等人設(shè)計(jì)合成了全部等人設(shè)計(jì)合成了全部1212種不同的引物，用種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄以反轉(zhuǎn)錄mrnamrna，合成第一鏈，合成第一鏈cdnacdna。這種引物通常。這種引物通常叫作叫作3-3-端錨定脫氧核苷酸引物，并用端錨定脫氧核苷酸引物，并用5-t11mn5-t11mn或或5-5-t12mnt12mn通式表示。其中通式表示。其中mm為除了為除了t t以外的任何一種核以外的任何一種核苷酸（即苷酸（即a a、g g或或c c），而

49、），而nn則為任何一種核苷酸（即則為任何一種核苷酸（即a a、g g、c c或或t t），故），故mnmn共有共有1212種不同的排列組合方種不同的排列組合方式。式。mrna: 5-mrna: 5-nmnmaaaaaaaaaaaaaa-3(12aa-3(12種序列種序列) ) 3- 3-nmnmtttttttttttttttt-5 tt-5 5-5-隨機(jī)引物隨機(jī)引物： 10-mer10-mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的種的mrnamrna。一般用。一般用2020種隨機(jī)引物和種隨機(jī)引物和1212種種3-3-端錨端錨定引物組成的全部定引物組成的全部

50、240240組引物對組引物對pcrpcr擴(kuò)增后，所產(chǎn)生擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約的大約20 00020 000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mrnamrna。 ddrt-pcrddrt-pcr（mrna differential disply reverse mrna differential disply reverse transcription polymerase chain reactiontranscription polymerase chain reaction） 由于在由于在cdnacdn

51、a群體中，代表特定細(xì)胞類型或發(fā)育群體中，代表特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段的階段的mrnamrna的含量非常低，所以要把一種只在的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細(xì)胞類型中表達(dá)、而在另一發(fā)育某一階段或某種細(xì)胞類型中表達(dá)、而在另一發(fā)育階段或某種細(xì)胞類型中不表達(dá)的目的基因分離出階段或某種細(xì)胞類型中不表達(dá)的目的基因分離出來，就需要來，就需要pcrpcr擴(kuò)增。擴(kuò)增。基本過程：基本過程： 1. 1. 從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細(xì)胞群體中分離總的細(xì)胞群體中分離總mrnamrna，并用，并用3-3-端錨定引物端錨定引物作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈

52、cdna;cdna; 2. 2.用用5-5-端隨機(jī)引物和端隨機(jī)引物和3-3-端錨定引物組成的引物端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標(biāo)記的對，在加入放射性同位素標(biāo)記的dntpdntp的條件下，的條件下，以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行pcrpcr擴(kuò)增。擴(kuò)增。 3.3.將擴(kuò)增樣品在變性的將擴(kuò)增樣品在變性的dnadna測序膠中進(jìn)行電泳分離測序膠中進(jìn)行電泳分離；4.4.將有關(guān)的差別表達(dá)的將有關(guān)的差別表達(dá)的dnadna條帶從測序膠上切割下來?xiàng)l帶從測序膠上切割下來回收其回收其dnadna片斷；片斷；5.5.膠塊中的膠塊中的dnadna量非常少，不能用于克隆，需進(jìn)行二量非常少

53、，不能用于克隆，需進(jìn)行二次擴(kuò)增；次擴(kuò)增；6.6.將克隆的特定的將克隆的特定的dnadna分別同基因組分別同基因組dnadna及總及總mrnamrna作作southernsouthern或或northernnorthern雜交，測序；雜交，測序；7.7.以此目的片斷作探針從以此目的片斷作探針從cdnacdna文庫中或基因組文庫中文庫中或基因組文庫中篩選全長的篩選全長的cdnacdna克隆或基因組克隆。克隆或基因組克隆。優(yōu)點(diǎn)： 1. 1.可以同時(shí)比較多個(gè)樣品表達(dá)的差異；可以同時(shí)比較多個(gè)樣品表達(dá)的差異； 2.2.可以同時(shí)檢測可以同時(shí)檢測“上游上游”及及“下游下游”的基因；的基因； 3.3.檢測靈敏度

54、高，所需樣品少，經(jīng)檢測靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)pcrpcr擴(kuò)增一些低擴(kuò)增一些低峰度的峰度的mrnamrna也可以被檢測出來；也可以被檢測出來； 4.4.結(jié)合使用了結(jié)合使用了pcrpcr和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使本方法顯得較單方便。本方法顯得較單方便。局限性： 1.假陽性比例高（假陽性比例高（50%50%75%75%）；）； 同一長度的條帶，含有多種同一長度的條帶，含有多種dnadna序列；鄰近條序列；鄰近條帶回收時(shí)，造成人為誤差；帶回收時(shí)，造成人為誤差； mrna3-mrna3-端序列保守性高，而常用端序列保守性高，而常用3-3-端端cdnacdna作探針。作探針

55、。 2.2.擴(kuò)增的差別條帶分子長度比較短小（擴(kuò)增的差別條帶分子長度比較短小（110110450bp450bp）；）； 應(yīng)用表達(dá)文庫應(yīng)用表達(dá)文庫 分離克隆的目的基因分離克隆的目的基因表達(dá)文庫分離克隆的目的基因表達(dá)文庫分離克隆的目的基因 當(dāng)沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的當(dāng)沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時(shí)，將探針時(shí)，將cdnacdna克隆在表達(dá)載體上，再導(dǎo)入大腸克隆在表達(dá)載體上，再導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞然后通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分桿菌寄主細(xì)胞然后通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。離克隆的真核目的基因。特點(diǎn)：1.表達(dá)的蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原表達(dá)的蛋白質(zhì)以

56、融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一個(gè)末端，不易被原核細(xì)胞中的有關(guān)蛋白酶消化降個(gè)末端，不易被原核細(xì)胞中的有關(guān)蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達(dá)水解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達(dá)水平。平。2. cdna片斷必須置于啟動(dòng)子序列下游，在其控制片斷必須置于啟動(dòng)子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入，確保產(chǎn)生之下；按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入，確保產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)。正確的蛋白質(zhì)。 篩選的方法篩選的方法： 1. 1. 利用抗體篩選表達(dá)文庫；利用抗體篩選表達(dá)文庫； 2. 2. 測定蛋白質(zhì)的功能；

57、測定蛋白質(zhì)的功能； 3. 3. 用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)的dnadna片斷作探針篩選表達(dá)文庫。片斷作探針篩選表達(dá)文庫。將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合2.測定蛋白質(zhì)的功能測定蛋白質(zhì)的功能 生物化學(xué)研究表明，存在生物化學(xué)研究表明，存在caca離子的條件下，離子的條件下，鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。 將放射性同位素標(biāo)記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選將放射性同位素標(biāo)記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選cdnacdna

58、表達(dá)文庫，鑒定能夠表達(dá)出與它特異性結(jié)合表達(dá)文庫，鑒定能夠表達(dá)出與它特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。 3.3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)的dnadna片斷作探針篩選表達(dá)文庫片斷作探針篩選表達(dá)文庫 鑒定能夠表達(dá)出與特定鑒定能夠表達(dá)出與特定dnadna片斷（片斷（真核啟動(dòng)真核啟動(dòng)子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的dnadna元件元件）結(jié)合的目標(biāo)蛋）結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆。白質(zhì)的克隆。酵母雙雜交體系酵母雙雜交體系 （two-hybrid system）酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱酵母雙雜交體系又叫相互作用

59、陷阱 (interaction trap)(interaction trap) 有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。的編碼基因。 應(yīng)用于真核基因地表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞粘合因子間的應(yīng)用于真核基因地表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞粘合因子間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究因子的鑒定與分離等研究基本原理：基本原理： 許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成（開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成（

60、exampleexample）；）； 應(yīng)用重組應(yīng)用重組dnadna技術(shù)，也可以將來自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的技術(shù)，也可以將來自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結(jié)構(gòu)域，在體、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活uasuas（上（上游激活序列）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。游激活序列）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。example: 釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子gal4gal4，在，在nn端端1 1147147位氨基酸區(qū)段有一個(gè)結(jié)合域（位氨基酸區(qū)段