1、單位及實驗室名稱項 目編號：ASJYK-LAB-C-P-53日期：2015年6月21日版本：第一版，第1次修訂第1頁，共3頁檢驗科HPV-DNA擴增熒光定量檢測標準操作程序1.目的：明確高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的操作規程，指導檢驗人員正確進行巨細胞病毒核酸定量的檢測。2.適用范圍：適用于進行高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測的檢驗人員。適合儀器：LightCycler480型核酸擴增熒光檢測儀方法原理：采用PCR方法結合熒光探針的擴增技術樣品要求：宮頸脫落細胞3.職責：實驗操作人員應嚴格按操作規程進行實驗。4.試劑來源：潮州凱普生物化學有限公司高危型人乳頭瘤病毒核酸定量檢測試劑盒。5.質控物

2、：陰性、陽性對照及陽性參控品系列均來源于試劑盒6.標準操作： 試劑準備（在試劑準備區操作）6.1.1將試劑盒及其它所需試劑置室溫解凍（臨用前取出，用后立即放回冰箱，反復凍融不可超過三次），取出PCR MIX,室溫下避光解凍，上下顛倒混勻后，8000轉/分鐘10s從試劑盒中取出DVA聚合酶，8000轉/分鐘lOs。根據當次實驗標本量，取出相應試劑（1管= MIX + DVA聚合酶）總的需求量于一管中（其余隨即放回原溫度保存），如所需要的管數為n (n=標本數+1空白管對照+1管陽性對照) 取PCR反應管轉移至樣本制備區。樣本處理(在樣本處理區進行)取宮頸脫落細胞樣本0. 5ml1ml(如果細胞數

3、量少可以加大體積到2m1) 13000轉/分鐘離心1分鐘棄上清，加入細胞保存液重懸細胞 13000轉/分鐘離心1分鐘，盡量棄干凈上清每樣本加入50ul細胞裂解液，充分振蕩重懸細胞，煮沸10分鐘。 13000轉/分鐘離心10分鐘，保留上清備用(上清中為釋放的DNA)。取上清作為PCR擴增的模板，其余保存于一20在對應的PCR反應管中分別加入2ul處理好的樣本DVA,空白對照、陽性對照，蓋緊管蓋，稍做離心(反應總體積為2o u 1/人份，每次反應需要設置一個陽性對照以及一個空白對照)。轉移到檢測區，放入相應的熒光PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序 PCR擴增（在擴增區操作）6.3.1打開穩壓器電源，

4、再打開計算機電源。6.3.2 打開擴增儀電源，按儀器操作規程進入擴增循環條件設定。設置四種熒光檢測通道的報告熒光、淬滅熒光;Passive Reference選擇none(見表1)ASJYK-LAB-C-P-53 第2頁，共3頁表1: 設置四種熒光檢測通道Detector NameTargetReporter DyeQuencherFAM12種高危型HPV (31, 33, 35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 5966，68)FAMnoneHEMHPV16HEX/JOEnoneROXHPV18ROX/Red 610noneCy5-globinCy5none將循環條件設定為Pr

5、ogramCyclesTemperature ()IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(/sec)AcquisitonModeAnalysisMode119510:00min20NoneNone2459515sec20NoneNone6060secSingleQuantification31385sec20NoneNone檢查反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄漏污染儀器。將待反應的PCR反應管放入擴增儀中，并根據實際情況和儀器操作規程在程序中設定好樣孔位置。按儀器操作規程開始循環。擴增結束后取出PCR反應管，關閉擴增儀電源，反應管直接放入

6、焚燒垃圾桶內。ASJYK-LAB-C-P-52 第3頁，共3頁分析數據，在Analysis Notes窗口中注明檢測基線值、試劑批號、陽參批號等相關信息，進行結果分析。關閉計算機。檢驗結果判斷：基線，閡值的設定:基線的確定為:取3-15個循環的熒光信號:閾值設定:使閾值線超過正常陰性對照品擴增曲線(無規則的噪音線)的最高點，且Ct值為Under質控對照1陰性對照Ct值均應顯示為Undet2陽性對照Ct值363內對照-globin在Cy5通道Ct值40符合以上三個條件，此反應是為有效結果判斷1樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值顯示為Undet，內對照-globin在Cy5通道Ct值40,判斷為陰性2樣本在FAM、HEX、ROX通道Ct值40, 內對照-globin在Cy5通道Ct值40判斷為陽性 3若樣本在FAM、HEX、ROX通道40Ct值45的樣本建議重做，重做結果Ct值40者為陽性，否則為陰性7.支持性文件： 高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒(PCR一熒光探針法)說明書（潮州凱普生物化學有限公司） 檢測結果報告程序。 Light