1、實驗九 總糖和還原糖的測定（二）3,&二硝基水楊酸法一、目的要求：掌握還原糖和總糖的測定原理，學習用比色法測定還原糖的方法。二、實驗原理 :?在NaOH和丙三醇存在下，3,5 二硝基水楊酸（DNS與還原糖共熱后被還原生 成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色， 在540nm波長處有最 大吸收，在一定的濃度范圍內，還原糖的量與光吸收值呈線性關系，利用比色法可 測定樣品中的含糖量。黃色？桔紅色三、試劑和器材1、試劑（1） 1 mg/ml葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg加少量蒸餾水 溶解后，以蒸餾水定容至 100ml，即含葡萄糖為1.0mg/ml。（2）3,5二硝

2、基水楊酸試劑： 稱取 6.3 g 3,5二硝基水楊酸并量取 262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸鉀納的熱溶液中（182 g酒石酸鉀納溶于500 ml水中），再加5 g 結晶酚和 5 g 亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到 1000 ml 貯于棕色瓶(3)碘碘化鉀溶液：稱取 5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中(4) 6N NaOH稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。(5) 0.1%酚酞指示劑。(6) 6 mol/L HCl 溶液2、材料小麥淀粉或玉米淀粉。3、器材分光光度計，天平，水浴鍋，電爐，試管若干等。四、操作方法？1、葡萄糖標準曲線制作取8支15mM 1

3、80mm試管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖標準液和蒸餾水。 管號試劑 01234567800.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖 標準液(ml)蒸餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4水楊酸溶液1.51.51.51.51.51.51.51.51.5(ml)葡萄糖含量00.20.40.60.81.01.21.41.6(mg)將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5 ml蒸餾水，搖勻入=540nm處測定吸光度以葡萄糖含量（mg為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線2、樣品中還原糖的提取準確稱取0.

4、5g小麥(淀)粉，放在 100ml燒杯中，先以少量蒸餾水(約2 ml) 調成糊狀，然后加入 40ml蒸餾水，混勻，于50C恒溫水浴中保溫20min，不時攪 拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。3、樣品總糖的水解及提取準確稱取0.5g小麥(淀)粉，放在錐形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml， 在沸水浴中加熱0.5h，取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否 完全。如已水解完全，則不呈現藍色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾

5、液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測定。4、樣品中含糖量的測定試劑空白還原糖總糖樣品溶液(ml)01.01.0蒸餾水(ml)2.01.01.0水楊酸(ml)1.501.501.50將各管溶液混合均勻，在沸水中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，再向每管加入21.5 ml蒸餾水，搖勻入=540nm處測定吸光度樣品溶液中還原糖和總糖測定后，取樣品的光吸收值在標準曲線上查出相應的糖量五、結果處理按下式計算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：式中：C還原糖或總糖提取液的濃度，mg/ml;V還原糖或總糖提取液的總體積，ml;m樣品重量，g;1000mg換算成g