1、HPLC同時測定護肝片中5種成分的不確定度分析【摘要】目的：建立 HPLC法測定護肝片中腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的不確定 度評定方法。方法：根據測量不確定度評定與表示的有 關規定，分析影響含量結果不確定度的因素來源，并對各不 確定度因素進行評定，計算合成不確定度，最終給出擴展不 確定度和報告不確定度。 結果：不確定度評估為腺苷 081%， 五味子醇甲 086%，五味子酯甲 067%，五味子甲素 074%， 五味子乙素 078%。結論：對照品的配制、樣品溶液、進樣 重復性的不確定度是肝片 5 種成分不確定度的主要來源。【關鍵詞】HPLC;護肝片；腺苷；五味子醇甲；五味

2、子酯甲；五味子甲素；五味子乙素；不確定度【中圖分類號】R2841【文獻標志碼】A【文章編號】1 007-85 1 7（ 20 1 6） 1 0-0033-04Abstract ： Objective To establish a HPLC method for uncertainty analysis of Adenosine 、 Schisandrin、 Schisantherin 、 Deoxyschizandrin and Schisandrin B in Hugan Tabelts. Methods According to the technical requirements of

3、Evaluation and expression of uncertainty in measurement ， each active component of uncertainty was calculated the variable parameters among the procedures. The combined uncertainty and extended uncertainty reported Uncertainty were finally obtained by synthesized the uncertainties of various compone

4、nt variables. Results The uncertainty for Adenosine was 081%， Schisandrin was086%， Schisantherin was 067%， Deoxyschizandrin was 074%and Schisandrin B was 078%. Conclusion The uncertainty of reference standard qualrity was the main source of five components measurement uncertainty in Hugan Tabelts.Ke

5、ywords：HPLC；Hugan Tabelts；Adenosine ；Schisandrin； Schisantherin ；Deoxyschizandrin；Schisandrin B； measurement uncertainty護肝片由柴胡、茵陳、板藍根、五味子、豬膽粉、綠豆 等六味中藥經提取、加工制成的中成藥，收載于 2010 年版 中國藥典一部 1 ，具有疏肝理氣，健脾消食，降低轉氨 酶的功效，臨床用于慢性肝炎及早期肝硬化等。測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性， 與測量結果相關聯系的參數 2 ，它是被測量客觀值在某一量 值范圍內的一個評定，其大小決定了測量結果的實用

6、價值。 測量不確定度是評價定量方法的可靠性與測量結果的可信 程度的主要內容之一，其重要性已得到廣泛認可。目前，測 量不確定度的評定在環境分析、食品檢驗、藥物分析等領域得到深入的研究和廣泛的應用 3-8 。研究根據測量不確定 度評定與表示（JJF1059-1999中有關規定，對護肝片中5種成分含量的測量不確定度進行分析，以找出影響不確定度 的因素，對不確定度進行評估，為評價檢測報告提供理論依 據，以控制測量結果的有效性和適宜性。1 儀器與材料11 儀器 Agilent 1200 系列高效液相色譜儀（ Agilent 1200 LC色譜工作站、 G1322A DEGASSE溶齊脫氣機、 G1311

7、A四 元泵、 G1329A 自動進樣器、G1314B VWD 紫外檢測器） ；CP225D電子天平（德國賽多利斯）；COBOS AW-120自動電子天平（西班牙）； SB3200WS 超聲波清洗器 （上海必能信） ； Type HT-203A column HEATER（天津市恒奧科技發展有限公 司）。12 材料 腺苷（批號： 110879-200202）、五味子醇甲 （批 號：110857-201412 ）、五味子酯甲 （批號： 111529-200302 ）、 五味子甲素（批號： 0764-200107 ）和五味子乙素（批號： 110765-200407）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所

8、。 護 肝片（批號： 20130512、 20141122 ，黑龍江葵花藥業股份有 限公司； 批號：20140702，廣東省惠州市中藥廠有限公司） 。 乙腈為色譜純，水為超純水，其余試齊為分析純。2 方法與結果21 色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （250 x 46 mm , 5卩m）;流動相：乙腈（A） 07%磷酸溶液（B）梯度洗 脫（見表1）;流速：08 ml/min ;檢測波長：014min ,260nm ; 140158min , 250nm ;柱溫：30 C；進樣量：10卩l。理論 板數按腺苷計應不低于 2500。22 溶液的制備221 混合對照品溶液

9、的制備分別精密稱取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品1469、1980、989、1112、1138 mg 置 25ml 量瓶，加 50%甲醇溶解 并定容至刻度，分別配制成對照品貯備溶液;各精密取 2ml 置 25ml 量瓶中，加 50%甲醇稀釋并定容至刻度（含腺苷 00470mg/ml 、五味子醇甲 00634mg/ml 、五味子酯甲 00316mg/ml 、五味子甲素 00356mg/ml 、五味子乙素 00364mg/ml 的溶液）即得。221 供試品溶液的制備取本品 10 片，除去包衣后，精密稱定，研細，取約 1 片的 量，精密稱定，精密加入 50%甲醇20mL，

10、稱定重量，超聲 處理（功率250W，頻率40KHz） 50min，放冷，用甲醇補足 減失的重量，搖勻，濾過，濾液用 045卩m微孔濾膜濾過， 取續濾液，即得。222 陰性對照溶液的制備按處方中藥味的比例，分別自 配不含板藍根和不含五味子的群藥，按其工藝制成陰性對照 樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。23 方法學考察231 線性關系的考察精密稱取腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素對照品適量，以50%甲醇為溶劑，配制成混合對照品溶液。倍比稀釋法配置成系列質 量濃度的溶液。進樣10卩I,測定各組分峰面積。以各組分 濃度（C）橫坐標，相應峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲

11、線，得回歸方程。腺苷：A=38133 C+13918，r=09998 ;五味子醇甲：A=20180 C+11309, r=10000;五味子酯甲：A=14253 C+59979，=09999 ;五味子甲素：A=17825 C+38007，=10000 ； 五味子乙素： A=26780 C-15709， r=09999。232 精密度試驗精密吸取同一供試品 （批號： 20130512）溶液10卩I,按上述色譜條件進樣，測定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積，重復進樣6 次，其 RSD分別為 085%、059%、105%、076%、081%。233 重復性試驗取同一批樣品

12、（批號： 20130512）約 1 片的量共 6 份,精密稱定,分別制備供試品溶液,各進樣 10 卩I，測定腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，結果 RSD分別為：183%、139%、221%、 179%、 150%。234 穩定性試驗取同一供試品 （批號： 20130512）溶液, 分別在0、1、2、4、6、& 10、12h時進樣10卩I，記錄色 譜峰面積,計算腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲 素和五味子乙素的峰面積的 RSD分別為152%、088%、191%、125%、 095%235 加樣回收率試驗精密量取已測定腺苷、 五味子醇甲、 五味子酯甲、 五味子甲素

13、和五味子乙素含量的護肝片 （批號： 20130512）樣品 9 份（每份約 05 片的量），精密稱定，每份 分別精密加入一定量的腺苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五 味子甲素和五味子乙素對照品， 制備供試品溶液， 進樣測定， 計算加樣回收率，結果平均回收率分別為9945%、 10010%、9919%、9969%、9988%。RSD分別為：159%、150%、178%、 171%、 150%。3 不確定度來源的識別及分析31 不確定度的來源從檢測過程和數學模型分析， 樣品中 5種成分含量的相對標準不確定度 ？Urel來源，主要包括： 對照品溶液濃度的相對標準不確定度 Urel（ Cs）；供試品溶 液

14、配制過程引入相對標準不確定度 Urel（V）；HPLC測定峰 面積相應值的相對標準不確定度 Urel（A）、Urel（As）。即：Urel=U2 rel （ Cs） + U2 rel （ V） + U2 rel （ As） + U2 rel （ A）32 對照品溶液濃度的相對標準不確定度Urel（ Cs）： Urel（Cs）的來源：對照片的純度的不確定度；對照品的稱量所產生的相對不確定度Urel （ms）;配制對照品溶液產生的相對不確定度 Urel（Vs）。321 對照品的純度的不確定度對照品腺苷、 五味子醇甲、 五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均購自中國藥品生物 制品檢定所， 由于尚無法得

15、到不確定度參考值， 故此項忽略。322 對照品的稱量所產生的相對不確定度Urel（ ms） 檢定證書中1/10萬天平稱量允差為 OOlmg，按矩形分布計算不 確定度為 u（ms1）=001/3=00058mg ；該天平稱量時重復性 標準偏差為 OOlmg，即u （ ms2） =001mg;腺苷、五味子醇 甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素5 種對照品的取樣量分別為 1469， 198O， 989， 1112， 1138mg ，則對照品稱 量所引起的相對標準不確定度為：腺苷： Urel（ ms 腺） =u（ms1 ） 2+u（ ms2） 2m=OOO582+OO121469=OO8%同理五味

16、子醇甲： Urel （ms醇）=006%;五味子酯甲： Urel （ ms 酯）=012%;五味子甲素：Urel （ ms 甲）=010%； 五味子乙素： Urel（ ms 乙） =010%。323 對照品溶液配制的相對不確定度對照品溶液配制過 程中分別使用了 25ml 量瓶與 2ml 移液管，其不確定度分別 如下：校準，A級25ml量瓶、2ml移液管的允許偏差分別 為土 003ml，土 001ml，按矩形分布計算不確定度為 003/3=00173ml，001/3=00058ml :重復性，用 A 級 25ml 量瓶與 2ml 移液管重復吸量蒸餾水 10 次，測得重復性不確 定度 u（ Vs2

17、5） =00034ml，u（ Vs2）=00010ml;溫度，環 境溫度為室溫（20 5）C，溶劑水的體積膨脹系數為21 X10-4，按矩形分布，環境溫度引入的不確定度為u( Ts25)=(5X 21 X 10-4X 25) /3=00152 C, u (Ts2) = (5X 21 X 10-4X 2) /3=00012 Co對照品溶液配制過程中分別使用了 25ml 量瓶 2 次， 2ml 移液管 1 次，因此對照品配制過程的引入的相對不確定度為：Urel( Vs25) =001732+000342+00152225=009%Urel( Vs2) =000582+000102+0001222=

18、030%Urel( Vs) =2X 000092+000302=033%因此， 對照品溶液濃度引入的相對不確定度分別為：腺苷：Urel (Cs腺)=000082+000332=034%;同理五味子醇甲：Urel(Cs醇)=034%; 五味子酯甲：Urel ( Cs酯)=035%；五味子甲素：Urel ( Cs 甲)=035%;五味子乙素：Urel ( Cs乙)=035%。33 供試品溶液配制過程中引入的相對標準不確定 Urel(V)供試品溶液在配制過程中使用了 20ml移液管，其不確 定度如下：校準，A級20ml移液管的允許偏差為土 003ml， 按矩形分布計算不確定度為003/3=00173

19、ml :重復性，用A 級 20ml 移液管重復吸量蒸餾水 10 次，測得重復性不確定 度u (Vs20) =00030ml;溫度，環境溫度為室溫(20 5) C, 溶劑水的體積膨脹系數為 21 X 10-4，按矩形分布，環境溫度 引入的不確定度為 u(Ts20) =(5X 21 X 10-4X 20)/3=00122 C。 則樣品溶液配制過程中引入的相對不確定度為：Urel(V) =001732+000302+00122220=011%34HPLC測定峰面積相應值的相對標準不確定度Urel （A）,Urel （As） Urel （A）, Urel （As）主要由重復進樣引起，由儀 器給出的進樣

20、峰面積標準偏差為隨機測量，屬A類不確定度。混合對照品溶液重復進樣 6 次，其峰面積的標準不確定度按 貝賽爾公式計算 S=E（ Ai-A） 2n-1，混合對照品中腺苷、五 味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相對標 準不確定度分別為 Urel （AS腺）=S腺A腺=059%, Urel （AS 醇）=s醇 A 醇=066%, Urel （AS酯）=S酯 A 酯=035%, Urel（AS 甲）=S 甲 A 甲=042%, Urel （AS 乙）=S 乙 A 乙=057%。同理,供試品中 5 種成份的相對不確定度分別為 Urel（ A 腺） =043%, Urel（ A 醇） =041%

21、, Urel（ A 酯） =044%, Urel（A 甲） =048%, Urel（ A 乙） =039%。35 計算合成不確定度將所有的不確定度分量進行匯總（表 2）,有利于更直觀分析各分量的大小。 對 5 種成分進行 合成不確定度計算,結果分別為：Urel 腺=U2rel （CS腺）+U2rel （V） +U2rel （AS腺）+U2rel （A 腺）=000342+000112+000592+000432=081%同理：Urel 醇=086%, Urel 酯=067%, Urel 甲=074%, Urel 乙 =078%。根據樣品測量方法得護肝片（批號： 20130512）中 5 種成分

22、的含量為 X腺=029mg/片，X醇=056mg/片，X酯=013mg/ 片，X甲=014mg/片，X乙=029mg/片。貝U 5種成分含量的相 對合成不確定度分別為mg/片，Ux醇=056 x 086%=00048mg/片，Ux 酯=013 x 067%=00009mg/ 片，Ux 甲=014 x 074%=00010mg/ 片，Ux 乙=029 x 078%=00023mg/ 片。36 計算擴展不確定度及測量結果取 95%的置信概率， 包含因子k=2,則U=2x Ux,本次實驗所測量樣品的含量及不 確定度見表 3。4 討論 分析評估不確定度，應盡量注意產生不確定度的所有來 源，因為合成不確定度的數值取決于重要的不確定度分量。從表 2 各標準分量的不確定度可知，本研究測定護肝片中 5 種成分結果的各分量不確定度均較小，