1、第十二章 細胞增殖及其調控,細胞增殖是生物繁育的基礎 細胞增殖受到嚴密的調控機制所監控,細胞增殖是生命的基本特征，種族繁衍、個體發育、機體修復等都離不開細胞增殖。 初生嬰兒有1012個細胞，成人1014個，約200種類型。 成人體內每秒鐘有數百萬新細胞產生，以補償衰老和死亡的細胞。 一個大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過地球的重量,細胞增殖（cell proliferation）包括細胞分裂及其物質準備兩個連續進行的過程。 細胞增殖調控是整個生命活動的最基本特征。 任何細胞，其增殖過程都必須遵守一定的規律。 在高等生物中，細胞增殖調控更為復雜，不僅要遵循細胞自身的增殖

2、調控規律，還有遵守生物體整體調控機制的調節。否則，不受約束而生成的細胞將被機體免疫系統清除，或者癌變，威脅整個生命,第一節 細胞周期概述,從一次細胞分裂結束開始，到下一次細胞分裂結束為止，稱為一個細胞周期。 細胞周期包括物質積累和細胞分裂的循環過程,1.1 細胞周期,細胞周期的分期 有絲分裂期（mitosis）； 分裂間期（interphase）：G1、S、G2； 細胞增殖狀況 周期中細胞（cycling cell）； G0期細胞，或靜止期細胞（quiescent cell）； 終末分化細胞,1.2 細胞周期中各個不同時期及其主要事件,G1期 物質合成 起始點、限制點、檢驗點： 細胞內存在的一

3、系列監控機制，可以鑒別細胞周期進程中的錯誤，并誘導產生特異的抑制因子，阻止細胞周期進一步運行,S期主要事件,DNA合成 復制受到多種細胞周期調節因素的嚴密調控，同時與細胞核結構如核骨架、核纖層、核膜等關系密切。 復制表現出嚴格的有序性：常染色質先復制，異染色質后復制；富含GC的序列先復制，富含AT的序列后復制。 真核細胞新合成的DNA立即與組蛋白結合，共同組成核小體結構。 新的組蛋白合成、中心粒的復制也是發生在S期,G2期、M期主要事件,各種物質和細胞結構為細胞進入M期作準備； G2期檢驗點：要檢查DNA是否完成復制，細胞是否已生長到合適大小，環境因素是否利于細胞分裂等。 只有當所有有利于細胞

4、分裂的因素得到滿足后，細胞才能順利實現從G2到M期的轉化。 M期 分裂期,1.3 細胞周期長短測定,脈沖標記DNA復制和細胞分裂指數觀察測定法 適用范圍：細胞種類簡單；周期時間較短；周期運轉均勻； 原理：短暫標記后，當時處于S期的全部細胞均被標記；以后陸續進入M期,T,PLM,常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM,細胞周期長短測定,流式細胞分選儀測定法 通過監測細胞DNA含量在不同時間內的變化，從而確定細胞周期時間長短； 原理因為G1期和G2/M期細胞含有固定的DNA含量，分別為1C和2C，而S期細胞的DNA含量介于1C和2C之間。 通過直接標記DNA復制，通過統計細胞數量和被標記

5、的分裂期細胞百分比，對細胞周期進行綜合分析,1.4 細胞周期同步化,應用某些藥物處理，將細胞抑制在細胞周期中的某個特定時期，然后，將細胞從抑制中釋放出來，所有細胞將會同步運轉。 自然同步化 人工選擇同步化 人工誘導同步化,人工選擇同步化,人為地將處于不同時期的細胞分離開來，從而獲得不同時期的細胞群體。 處于對數生長期的單層培養細胞，分裂期的細胞收集，離心，將其培養，細胞即開始同步分裂，并進行細胞周期運轉，即可得到不同時相的細胞。 缺點：效率低，成本高； 密度梯度離心法：某些細胞如裂殖酵母，不同時期的細胞在體積和重量上差別顯著，可以采用密度梯度離心方法分離出處于不同時期的細胞。 缺點：適用范圍十

6、分有限,人工誘導同步化,通過藥物誘導，使細胞同步化在細胞周期中某個特定時期。 DNA合成阻斷法 DNA合成抑制劑：TdR；羥基脲（HU）； 方法：將一定劑量的抑制劑加入培養液并繼續培養一定時間（TG2TM TG1），所有細胞即被抑制在S期； 分裂中期阻斷法 藥物：秋水仙素、秋水仙胺、nocodazole； 將細胞阻斷在細胞分裂的中期，處于間期的細胞，受藥物的影響相對較弱，常可以繼續運轉到分裂期。 條件依賴性突變株在細胞周期同步化中的應用 將突變株轉移到限定條件下培養，所有細胞便同步化在細胞周期中某一特定時期,第二節,細胞分裂,2 . 1 有絲分裂,1.2.1 有絲分裂過程 前期(prophas

7、e)； 前中期(premetaphase)； 中期(metaphase)； 后期(anaphase)； 末期(telophase,一）前期 染色質凝縮，分裂極確立與紡錘體開始形成，核仁解體，核膜消失,二）前中期 核膜解體到染色體排列到赤道面(equatorial plane) 上,三）中期 染色體排列到赤道面上,圖片來自http:,四）后期 指妹妹染色體單體分開并移向兩極的時期。分為后期A、后期B兩個過程,五）末期 從子染色體到達兩極，至形成兩個新細胞為止的時期。涉及子核的形成和胞質分裂兩個方面,Dividing Muscle Myoblast (primative muscle cell)

8、(SEM x8,000,胞質分裂,胞質分裂（cytokinesis）開始于分裂后期，完成于分裂末期； 分裂溝 中間體：分裂溝下方由微管、小泡膜聚集構成的一個環形致密層； 收縮環：肌動蛋白和肌球蛋白而成,植物細胞末期近兩極處紡錘絲消失，中間微管保留，并數量增加，形成成膜體。 來自高爾基體囊泡沿微管轉運到成膜體中間。融合形成細胞板(cell plate)，囊泡的內含物形成初生壁和中膠層，囊泡膜形成質膜，融合留下的管道形成胞間連絲,動物細胞的胞質分裂通過胞質收縮環的收縮實現，收縮環由大量平行排列的肌動蛋白組成,胞質分裂過程,分裂溝位置的確立； 肌動蛋白聚集和收縮環形成； 收縮環收縮； 收縮環處質膜融

9、合并形成兩個子細胞,分裂溝的定位,分裂溝的定位與紡錘體的位置明顯相關； 極性微管參與分裂溝的形成：兩極發出的星體微管末端相互重合，微管末端對細胞皮層刺激，促進分裂溝的形成,2.1.2 與有絲分裂直接相關的亞細胞結構,中心體 星體：中心體與四射的微管合稱星體，當細胞走向分離時，星體參與裝配紡錘體。 中心體功能：微管裝配（MTOC）；細胞分裂； 中心體周期：G1S完成復制；G2期一對中心體開始分離；細胞分裂結束，每一個細胞含有一個中心體,S期中心粒已完成復制，在前期移向兩極，兩對中心粒之間形成紡錘體微管，核膜解體時，中心粒已到達兩極，并形成紡錘體,動粒和著絲粒,動粒周期：每條中期染色體含有兩個動粒

10、，分別位于著絲粒的兩側，細胞分裂后，兩個動粒分別被分配到兩個子細胞中。當細胞再次進入S期后，動粒又會重新復制。 動粒功能：染色體依靠動粒捕捉紡錘體微管，沒有動粒的染色體不能與紡錘體微管發生有機聯系，也不能和其它染色體一起向兩極運動,紡錘體,主要成分：微管和微管結合蛋白； 動力蛋白在中心體微管之間搭橋； 正向動力蛋白（如：KRPs）：借助向微管正極運動，將紡錘體拉長。 負向動力蛋白（如：細胞質動力蛋白）：借助向負極運動，將被結合的微管牽拉在一起，組成紡錘體微管，中心體自然構成紡錘體的兩極。在細胞膜與星體微管之間搭橋，借助負向運動，將星體接近兩極的細胞膜，紡錘體拉長,星體微管 兩端為星體微管 動粒

11、微管 中間是紡錘體微管：一端與中心體相連，另一端與動粒相連； 極微管 一端與中心體相連，另一端游離（搭橋,紡錘體微管類型,紡錘體的裝配,中心體列隊：負向運動的動力蛋白在來自姐妹中心體的微管之間搭橋，通過向負極運動，將被結合的微管牽拉在一起，組成紡錘體微管； 紡錘體拉長：正向運動的動力蛋白在紡錘體微管之間搭橋，借助向微管正極運動，將紡錘體拉長，中心體之間的距離逐漸加大。一定程度后，負向一定的動力蛋白在細胞膜和星體微管之間搭橋，借助負向運動，將星體拉近兩極的細胞膜，紡錘體也進一步被拉長,2.1.3 有絲分裂過程中染色體運動的機制,染色體列隊 微管捕獲染色體動粒微管； 染色體移動至赤道板； 牽拉假說

12、：染色體向赤道板方向的運動是由于動粒微管牽拉的結果，動粒微管越長，拉力越大，當來自兩極的動粒微管的拉力相等時，染色體即被穩定在赤道面上； 外推假說：染色體向赤道板方向的運動是由于星體微管排斥力，染色體距離中心體越近，推力越大，當來自兩極的推力達到平衡時，染色體即被穩定在赤道板上,2.1.3 有絲分裂過程中染色體運動的機制,染色體分離 后期A 動力蛋白向極部運動；動粒微管解聚；染色單體彼此分離； 后期B 極性微管加長，KRPs向微管正極行走，極性微管重疊區變窄； 胞質動力蛋白在星體微管和細胞膜之間搭橋，并向星體微管負極運動；兩極之間的距離變長,Anaphase A: separation of

13、the sister chromatids,Anaphase B: separation of the poles,植物細胞有沒有后期B ,2.2 減數分裂,定義：減數分裂是一種特殊形式的有絲分裂，是生殖細胞成熟過程的重要階段，一次減數分裂包括兩次連續的有絲分裂，但DNA只復制一次，結果一個細胞產生4個子細胞，每個細胞中染色體數減數了一半。 意義：既有效地獲得父母雙方的遺傳物質，保持后代的遺傳性，又可以增加更多的變異機會，確保生物的多樣性，增強生物適應環境變化的能量。 因此減數分裂是有性生殖的基礎，是生物遺傳、生物進化和生物多樣性的重要基礎保證,減數分裂,同源染色體分離,姐妹染色單體分離,減數

14、分裂過程,第一次減數分裂,間期 DNA的復制，細胞含4n染色體。 前期 中期 有絲分裂器 后期 二分體中每一條染色單體上DNA組成不同 末期 產生2個子細胞，每個細胞中含有n個二分體,前期,細線期：染色粒、染色線； 偶線期：聯會二價體； 聯會復合體 粗線期：四分體；交叉和交換； 雙線期：交叉的端化； 終變期：核膜、核仁消失；二價體高度螺旋化、擴散,聯會復合體,同源染色體之間形成的結構 重組節 與交換有關的結構，含有大量的與DNA重組有關的酶，是一個多酶復合體。其數目與交換的數目大致相當,聯會復合體結構 3條縱帶（側體 2、 中央成分） 橫纖維,synaptonemal complex,第二次減

15、數分裂,前期 中期 后期 末期,2.3 有絲分裂與減數分裂比較,有絲分裂與減數分裂的意義,有絲分裂：子細胞保持了母細胞完全相同的遺傳物質，有利于多細胞生物的個體發育，以及物種的穩定性 減數分裂: 使有性生殖成為可能（產生含半數染色體的配子）；其間的遺傳重組使生物的變異空間極大，是生物進化的物質基礎,染色體重組 1,染色體重組 2,Minimum number of gamete types = 2n , In humans, n = 23,第三節 細胞周期的調控,3.1 研究背景,MPF的發現及其作用 MPF稱為卵細胞促成熟因子或細胞促分裂因子或M期促進因子； MPF的實質：MPF是一種蛋白激

16、酶，主要含p32和p45。 p34cdc2激酶的發現及其與MPF的關系 cdc（cell division cycle）基因產物促進G2/M的轉換； cdc2的產物即p34cdc2，當其與有關蛋白結合后，其激酶活性才能表現出來； 結論：MPF含有兩個亞單位，即Cdc2蛋白和周期蛋白。當二者結合后，表現出蛋白激酶活性。cdc2為其催化亞基，周期蛋白為其調節亞基,早熟凝集染色體 (prematurely condensed chromosome，PCC,Leland H. Hartwell,R. Timothy (Tim) Hunt,Sir Paul M. Nurse,2001年10月8日美國人L

17、elandHartwell、英國人Paul Nurse、TimothyHunt因對細胞周期調控機理的研究而獲諾貝爾生理醫學獎,MPF(M-Cdk): p34cdc2 cyclinB,Two subunits: Catalytic subunit transfers P from ATP to Ser and Thr; Regulatory subunit called cyclin (Marine Biological Lab.at Woods Hole and UC Berkeley Univ. of Oxford-yeast,3.2 周期蛋白,周期蛋白其含量隨細胞周期進程變化而變化，一般在

18、細胞間期內積累，在細胞分裂期消失，在下一個細胞周期中又重復這一消長現象，稱為細胞周期蛋白（cyclin）。 周期蛋白分子結構特點： 周期蛋白框（cyclin box）：介導周期蛋白與CDK結合。 破壞框 PEST序列 周期蛋白的功能：不同的周期蛋白在細胞周期中表達的時期不同，并與不同的CDK結合，調節不同的CDK激酶活性。作用于細胞周期不同階段的進程,Destruction Box in Cyclins,3.3 CDK激酶和CDK激酶抑制物,CDK激酶即周期蛋白依賴性蛋白激酶 CDK激酶有兩個亞基，二者結合表現出激酶活性。 周期蛋白作為調節亞基 CDK蛋白作為催化亞基,CDK激酶的結構： CD

19、K激酶結構域：保守程度不一，其中的PSTAIRE序列相當保守，此序列與周期蛋白的結合有關。 磷酸化位點：其上的磷酸化修飾，對CDK激酶活性起重要調節作用,CDK activating,Cdk的三種活性狀態,失活狀態：T-loop; 半活性狀態 ：T-loop 被移除 活性狀態 ：磷酸化,3.4 細胞周期運轉調控,CDK激酶對細胞周期起核心調控作用； 不同種類的周期蛋白與不同種類的CDK結合，構成不同的CDK激酶； 不同的CDK激酶在細胞周期的不同時期表現出活性，因而對細胞周期的不同時期進行調節,CDK激酶活性的調節,激活周期蛋白起激活作用； 抑制細胞中存在一些對CDK激酶活性起負調控作用的蛋白

20、質，稱為CDK激酶抑制物（CDKI,3.4.1 G2/M期轉化與CDK1激酶的關鍵性調控作用,CDK1激酶活性依賴于周期蛋白B含量的積累； CDK1激酶活性 通過使某些蛋白質磷酸化，改變其下游的蛋白質的結構和活性，實現其調控作用； CDK激酶活性受到多種因素的綜合調節： 周期蛋白的結合是先決條件； weel/mik1激酶和CDK激酶催化CDK磷酸化； Thr14和Tyr15去磷酸化； 至此，CDK激酶才能表現出激酶活性,3.4.2 分裂中期分裂后期轉化,APC后期促進因子：APC1APC8; APC活化(泛素化活性)，降解M期周期蛋白，使M期CDK激酶活性喪失；解除對姐妹染色單體分離的抑制，細胞由中期向后期轉化。 APC活性受到多種因素的綜合調節： M期CDK激酶活性可能對APC的活性起調節作用：APC的多個成分被M期CDK激酶磷酸化； Cdc20為APC有效的正調控因