1、第六章,轉(zhuǎn)基因生物,本章內(nèi)容,6.1轉(zhuǎn)基因的方法和原理 6.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 6.3轉(zhuǎn)基因植物 6.4轉(zhuǎn)基因生物和生物安全性,6.1轉(zhuǎn)基因的方法和原理,6.11目的基因制備和載體系統(tǒng) 6.12幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法 6.13定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng),簡介,轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。 轉(zhuǎn)基因通過獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過程來實(shí)現(xiàn)。 轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造,基本步驟,1.分離獲得目的基因； 2.在體外進(jìn)行DNA

2、重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上； 3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞； 4.篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克隆； 5.將此克隆,6.11目的基因制備和載體系統(tǒng),目的基因來源：基因組DNA分離、化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增、cDNA文庫及DNA文庫中制得。 載體：質(zhì)粒、噬菌體 、柯氏質(zhì)粒 、YAC載體 等 工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶 等,PCR反應(yīng),PCR技術(shù)就是在體外通過酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。 PCR要求反應(yīng)體系具有以下條件： 1、要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)； 2、具有熱穩(wěn)定性的酶如Taq DNA

3、聚合酶； 3、4種dNTP； 4、作為模板的目的DNA序列。 PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出1005000bp的目的基因,PCR反應(yīng)過程,1、變性，即將模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA； 2、退火，將反應(yīng)體系的溫度降低至55左右，使得一對(duì)引物分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)； 3、延伸，將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到Taq DNA聚合酶作用的最適溫度72，然后以目的基因?yàn)槟０澹铣尚碌腄NA鏈。 反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列,利用cDNA法,由于真核生物的mRNA具有poly A這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以用結(jié)合長度大約為15bp的短鏈多聚DT的纖維素填充的柱子，根據(jù)堿基

4、配對(duì)原則，將其吸附，從真核細(xì)胞的總RNA中提取出來，再用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫。 在mRNA群體中，有高豐度的mRNA，拷貝數(shù)多；也有低豐度的mRNA，但種類多，高豐度的mRNA容易合成cDNA。 要保證構(gòu)建的cDNA文庫中要含有目的克隆，可利用瓊脂糖凝膠電泳、非變性蔗糖梯度離心和羥甲基蔗糖剃度離心等分級(jí)分離不同長度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分級(jí)分離,cDNA鏈的合成,得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶I，緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作為引物，合成cDNA。 這些cDNA是由該種生物的各種mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到的，因此是混合物，它們可

5、以通過末端連接或是加入銜接物等其它方法克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，形成cDNA文庫。 然后，采用DNA雜交或免疫分析的方法來篩選目的基因,質(zhì)粒載體,質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在，其大小不定，小的不到1kb，大的超過500kb。 每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能達(dá)10100個(gè)拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中只有14個(gè)拷貝。 質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進(jìn)行遺傳改造，使之成為一個(gè)具有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、多個(gè)選擇性標(biāo)記、并一般小于15kb且以高拷貝數(shù)存在的克隆

6、載體。其最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右,質(zhì)粒載體pBR322,1.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個(gè)抗生素抗性基因 2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamH I、Hind 和Sal I 三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。 3.Pst I識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基因。 4.pBR322帶有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進(jìn)行復(fù)制功能,pUC19質(zhì)粒,長2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖苷酶基因（lac Z）的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lac Z基因表達(dá)的阻礙蛋白的基因lac I，還有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。 pUC19的篩選將轉(zhuǎn)

7、化細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和Xgal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)胞由于能夠形成具活性的半乳糖苷酶，所以菌落是藍(lán)色，如果插入有目的DNA片段，無法形成雜合半乳糖苷酶，菌落時(shí)白色的,噬菌體,噬菌體染色體是長約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個(gè)5末端都是由12個(gè)bp組成的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)。 在噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因（J-N）與重組和生長過程有關(guān)，但與裂解生長過程無關(guān)，因此對(duì)裂解生長過程來說，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在

8、這個(gè)區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞裂解等,噬菌體載體,分類：插入型載體和置換型載體。 插入型載體：具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。 置換型載體：有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。 噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長度約為24kb，只需將噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒,柯氏質(zhì)粒 Cosmid,柯氏質(zhì)粒可克隆攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)。 柯氏質(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位（RE2），

9、兩個(gè)cos位點(diǎn)，DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE1,6.12幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法,基因轉(zhuǎn)移（transgenosis）是借助于物理、化學(xué)或生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并檢查其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的一種技術(shù)，是細(xì)胞工程中一項(xiàng)重要而應(yīng)用廣泛的技術(shù)。 細(xì)胞直接攝取外源DNA的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），如果通過噬菌體的釋放和感染將DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction,基因轉(zhuǎn)移的方法,DNA-磷酸鈣沉淀法,磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞株中去的最常用方法，主要用于將基因?qū)雱?dòng)

10、物細(xì)胞。 由于核酸以磷酸鈣DNA共沉淀物的形式存在，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收會(huì)大大提高，細(xì)胞通過內(nèi)吞作用，使DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移整合到細(xì)胞核內(nèi)的染色體內(nèi)。 一般是將DNA與CaCl2 溶液混合后，同時(shí)加入HEPES緩沖的鹽溶液（HeBS）混合，靜置后形成DNA磷酸鈣沉淀物，然后用來轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。這個(gè)過程中，pH值、Ca 2濃度等都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染的效率有所影響。方法簡單，效率較高，可達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞的20，但缺點(diǎn)是受體細(xì)胞有限,脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包裝DNA的球狀磷脂雙分層膜結(jié)構(gòu)，能與細(xì)胞膜融合將DNA送入細(xì)胞的。 用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染各種不同的類型的真核細(xì)胞的方法

11、具有較高的轉(zhuǎn)化效率和可重復(fù)性。 脂質(zhì)體制備的基本方法是以一定比例稱取磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，放于氯仿中之后加入待轉(zhuǎn)移的DNA分子制成懸液，經(jīng)超聲化處理后，即形成包含DNA分子的脂質(zhì)體，然后與培養(yǎng)細(xì)胞作用2小時(shí)左右，就可望實(shí)現(xiàn)DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率受脂質(zhì)體的組成及理化性質(zhì)的影響。 脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和體外的瞬時(shí)穩(wěn)定表達(dá),顯微注射DNA,顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去的方法，在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中較常使用。現(xiàn)在，多利用顯微鏡操作器在相差顯微鏡下進(jìn)行操作。每個(gè)細(xì)胞的注射量約為1011 ml，熟練的操作者每10分鐘可注射2

12、00個(gè)細(xì)胞,顯微操作儀,顯微操作儀的使用,顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作把微吸管的先端在顯微鏡的視野中作平面移動(dòng)。上下的運(yùn)動(dòng)靠設(shè)在顯微操縱儀支柱上的上下微動(dòng)，粗動(dòng)調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。它與顯微鏡牢固地連接起來。右側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡本體上，左側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡的機(jī)械臺(tái)上，隨機(jī)械臺(tái)的移動(dòng)而移動(dòng)，一般在進(jìn)行操作時(shí)，先將平皿放置在顯微注射儀上，移動(dòng)載物臺(tái)，把視野移到細(xì)胞處，先用緩慢移 動(dòng)顯微操縱儀上固定細(xì)胞的微吸管，同時(shí)使注射器緩慢減壓，吸引目標(biāo)受精卵并固定之，再用另一側(cè)顯微操縱儀移動(dòng)微注射針，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核刺入，導(dǎo)入目的基因，完成顯微注射,顯微注射法的優(yōu)點(diǎn),1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20，特別

13、是在沒有合適的DNA載體系統(tǒng)時(shí)更有價(jià)值； 2）對(duì)各種受體細(xì)胞均適用，從體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞到受精卵；3）對(duì)轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可以是DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、代謝物或代謝底物以至細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞核； 4）可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度； 5）可選擇受體細(xì)胞的核的接受位點(diǎn)，可研究物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)，區(qū)隔化和依賴區(qū)隔的修飾； 6）受體不用特殊的選擇系統(tǒng)； 7）要求的樣品量少，2ml樣品足夠作顯微注射； 8）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞可以化同樣的條件下比較。但也有缺點(diǎn)，如設(shè)備和技術(shù)的要求較高，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，對(duì)細(xì)胞有損傷,基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移,基因槍法最早是由美國康奈爾大學(xué)的Sanford最先

14、提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的,基因槍轉(zhuǎn)化的原理,決定基因槍使用成功的因素,第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。 根據(jù)動(dòng)力系統(tǒng)，基因槍分為三大類：一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動(dòng)力；第三類是以高壓氣體作為動(dòng)力。 第二因素是微彈的制備過程 。用的微載體有兩類：一是鎢粉，另一個(gè)是金粉，直徑一般為0.64m。 常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。 第三個(gè)因素是受體材料的選擇,6.13定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng),基因打靶（gen

15、e targeting）又稱同源重組技術(shù)，也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)組成部分。 利用轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后，通過外源基因序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源基因序列間的重組，將外源基因定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞基因組上的某一確定位點(diǎn)，而對(duì)某一預(yù)先確定的靶位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突破的一項(xiàng)技術(shù),基因敲除的載體,O型載體，又稱序列插入型載體，這類載體與靶基因組同源重組配對(duì)，經(jīng)過一次交換，前者插入后者，它發(fā)生單交換而將載體序列插入靶基因內(nèi)，致使染色體DNA部分重復(fù)，可能破壞內(nèi)在正常基因而發(fā)生突變，也可代替原來缺陷基因，糾正遺傳特征，使靶基因特異失活。 型載體，也稱序列取代載體，外來載體DNA和靶細(xì)胞染色體DNA同源配對(duì)，

16、經(jīng)過兩次交換，前者取代后者，此類載體可與靶序列發(fā)生雙交換，以外源序列取代靶序列，其基因組大小并無改變,靶細(xì)胞,基因敲除的靶細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞；既可是植物細(xì)胞，也可是動(dòng)物細(xì)胞。對(duì)于單細(xì)胞生物和體細(xì)胞具有全能性的植物來所，對(duì)靶細(xì)胞選擇要求不高，對(duì)任一細(xì)胞打靶成功都可獲得純系個(gè)體。但對(duì)于動(dòng)物，普通細(xì)胞敲除卻無法得到純系個(gè)體，小鼠生殖系嵌合體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展卻提供了理想的胚胎干細(xì)胞靶細(xì)胞。 胚胎干細(xì)胞體積大，胞漿少；體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落形生長，在集落邊緣有時(shí)可見有少量的已分化細(xì)胞，形態(tài)為扁平上皮細(xì)胞樣或梭形成纖維細(xì)胞樣,轉(zhuǎn)入方法,構(gòu)建的基因敲除載體，經(jīng)線性化后通常采用電穿

17、孔的方法將DNA引入胚胎干細(xì)胞。一般電壓為220800V，電容從0.3500F不等，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)開始用含200gG418（或/和其他物質(zhì)）的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，經(jīng)過812天未整合外源DNA的胚胎干細(xì)胞都已死亡，而整合了外源DNA的胚胎干細(xì)胞則長出了顯微鏡下可見到的克隆。 該方法的突出優(yōu)點(diǎn)在于其可靠性和重復(fù)性,正負(fù)選擇法,6.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,6.21轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法 6.22轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值,6.23轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法,1974年，Jaenish和Mintz應(yīng)用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了AV40 DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。 Palmiter等人于1982年將大鼠的生長激素基因?qū)胄∈?/p>

18、受精卵的雄原核中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)轟動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)界,反轉(zhuǎn)錄病毒法,利用反轉(zhuǎn)錄病毒可以轉(zhuǎn)移小片段DNA（10kb） 缺陷：可能導(dǎo)致產(chǎn)生輔助病毒株,DNA顯微注射,一種注入的外源基因序列,利用胚胎干細(xì)胞,篩選和鑒定,可以利用正負(fù)選擇法或PCR檢測(cè)外源DNA是否整合到染色體的正確位點(diǎn),PCR檢測(cè),6.24轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用價(jià)值,1）用于各種人類遺傳疾病的模型 以轉(zhuǎn)基因鼠居多，例如在老鼠中轉(zhuǎn)入突變的人珠蛋白基因，會(huì)產(chǎn)生地中海型貧血癥。 2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型還可以用于人類病毒病的研究。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可將病毒的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。人們利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)培育了引入HIV的tat蛋白的轉(zhuǎn)基

19、因鼠模型,3）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為乳腺生物反應(yīng)器,將所需要的目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞，使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌的乳汁中含有所需的藥用蛋白,生產(chǎn)藥用蛋白,1.抗凝血酶：轉(zhuǎn)基因羊中得到，產(chǎn)量為7g/l 2.乳球蛋白：轉(zhuǎn)基因小鼠，0.12mg/ml 3.紅細(xì)胞生成素（EPO）:轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁0.5ug/ml 4.1抗胰蛋白酶（AAT）:轉(zhuǎn)基因羊60mg/ml 5.因子:轉(zhuǎn)基因羊的乳汁125ug/ml的重組蛋白 6.因子：轉(zhuǎn)基因豬12.7ug/ml 7.單克隆抗體:轉(zhuǎn)基因小鼠中得到 8.C蛋白：轉(zhuǎn)基因豬每小時(shí)分泌380ug/ml 9.生長激素：轉(zhuǎn)大鼠GH基因豬最高，血清中740ng/

20、ml,4）膀胱生物反應(yīng)器：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不會(huì)對(duì)生物造成傷害，宜用UP作為啟動(dòng)子，但由于含量低，成本和乳腺反應(yīng)器差不多。 5）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液表達(dá)系統(tǒng)： 例如：Swanson等人制備了血液中含有人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因豬。 6) 轉(zhuǎn)基因改良移植器官： 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造異種來源器官的遺傳性狀，使之能適應(yīng)人體器官或組織的移植。例如導(dǎo)入補(bǔ)體控制因子基因的轉(zhuǎn)基因豬獲得成功，為培育異體移植的供體豬開辟了道路,7）轉(zhuǎn)基因生物獲得更多經(jīng)濟(jì)利益,轉(zhuǎn)基因牛：改變牛奶成分及提高產(chǎn)奶量 轉(zhuǎn)基因羊：改良羊毛生長 轉(zhuǎn)基因魚：生長速度提高，以及導(dǎo)入抗凍蛋白基因、珠蛋白基因的魚 轉(zhuǎn)基因雞：改良現(xiàn)有品種的遺傳特性，增強(qiáng)雞對(duì)于

21、感染的抵抗能力，降低對(duì)疾病的易感性，還可以將母雞產(chǎn)生的外源蛋白收集到蛋內(nèi)，以供醫(yī)療和保健之用,6.3轉(zhuǎn)基因植物,6.31制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法 6.32轉(zhuǎn)基因植物與高技術(shù)農(nóng)業(yè),6.31制作轉(zhuǎn)基因植物的基本方法,土壤農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生冠癭瘤，這是由于Ti質(zhì)粒上有一段TDNA，能轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)入植物基因組中，導(dǎo)致冠癭瘤形成。 TDNA的長度約在1224kb之間。 Vir區(qū)的產(chǎn)物對(duì)于TDNA的轉(zhuǎn)移是必須的,農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制,Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體,Ti質(zhì)粒衍生的克隆轉(zhuǎn)化載體必須具備以下的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 1）具有選擇標(biāo)記基因 2）DNA復(fù)制起始位點(diǎn) 3）TDNA右邊緣序列 4）單克隆位點(diǎn) 5）vir區(qū)域，利用雙元載體系統(tǒng)和共整合載體系統(tǒng)解決,實(shí)現(xiàn)vir區(qū)的方法,雙元載體,共整合載體和農(nóng)桿菌質(zhì)粒重組過程