納米孔單分子測序技術及其應用簡介（中國器審2024年08月15日）單分子測序（Single-moleculeSequencing，SMS）是在第一代Sanger測序、第二代NGS高通量測序技術的基礎上發展起來的第三代測序技術。因其測序時DNA分子無需PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序而得名。HelicoBioscices公司基于合成測序理論于2008年推出了世界上第一款單分子測序平臺HeliScope，但其測序的平均讀長相對較短，系統整體測序錯誤率較高[1]。之后出現了單分子的長讀長測序技術，目前已經實現商業化的長讀長測序技術主要有PacificBiosciences（PacBio）公司的單分子實時測序技術（Single-moleculeReal-time，SMRT）和OxfordNanopore公司（OxfordNanoporeTechnologies，ONT）的納米孔測序技術[2]。SMS和SMRT技術主要是將４種不同的堿基轉化為熒光信號，然后通過轉化放大后的信號對堿基進行區分。而納米孔測序技術則是將４種堿基轉換為電信號，然后對電信號進行收集、整理、轉化與數據輸出，與單分子熒光測序技術在信號處理上存在較大差異，故而納米孔測序技術也被稱為第四代測序技術。本文將主要介紹納米孔單分子測序技術的原理、特點及其在體外診斷領域的應用。一、納米孔測序的原理納米孔單分子測序技術是基于電信號測序的技術，相對于其他測序技術，納米孔測序技術的樣本處理極其簡單，無需DNA聚合酶或者連接酶，也無需dNTPs，其測序過程中包含了以下幾種關鍵物質，如圖1、圖2所示。納米孔蛋白（Nanopore），可以嵌入到細胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔。多聚物薄膜（Membrane），跨膜蛋白會被嵌入到高電阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜兩側是離子溶液，在兩側加不同的電位，離子就會在孔中流動，形成電流。馬達蛋白（Motorprotein），在納米孔測序文庫構建時，需要在接頭上連接一種馬達蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。連接臂（Tether），用于錨定DNA或RNA鏈，防止其在溶液中飄動，并使其進入納米孔中。將人工合成的多聚物膜浸沒在離子溶液中，膜上布滿了由解旋酶和蛋白孔兩部分組成的跨膜通道蛋白納米孔，在膜兩側施加不同電壓形成電壓差。由于多聚物膜不可導電，電流只能通過納米孔進行傳導。連接臂引導待測鏈進入納米孔，待測鏈在馬達蛋白的牽引下經解螺旋后以單鏈形式穿過納米孔（如圖1）。不同堿基在通過納米孔的恒定的電場時會引起電流不同幅度的變化，使用計算機軟件及人工智能算法識別并推斷出堿基類型，從而完成了DNA或RNA的測序[3]（如圖2）。二、納米孔的類型1.生物納米孔納米孔測序的概念首次在80年代被提出，并且隨著納米孔蛋白及馬達蛋白的技術發展而得以實現。第一個被發現可以通過DNA或RNA影響離子電流并能使之被檢測到的納米孔蛋白是1996年Kasianowicz等提出的α-溶血素蛋白[4]。但是因DNA通過納米孔的速率過快，而無法獲得有效的電流信號。之后的2010年，恥垢分枝桿菌蛋白A（Msp-A）納米孔被發現可以減緩DNA穿過納米孔的速度，提高DNA單堿基的檢測靈敏度[5]。隨后，2014年研究者發現使用phi29DNA聚合酶作為馬達蛋白[6]，可以控制DNA穿過納米孔的速度。生物納米孔主要包含以上3種，均為由某種蛋白質分子鑲嵌在磷脂膜上形成的天然納米孔，可以進行靈活的生物化學修飾。然而生物納米孔在膜穩定性、電流噪聲等方面的問題在一定程度上限制了其發展。牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應用方面取得了一定進展，他們的GridION和MinION系統就是基于生物蛋白納米孔的測序平臺。

2.

固態納米孔Li等在2001年開啟了固態納米孔的研究[7]。固態納米孔主要是在氧化硅、石墨烯等固態材質上通過離子束刻蝕等技術制備出的納米孔，因其尺寸可調、可靠性高、易修改等優點，被廣泛應用于DNA測序、蛋白質檢測和能量轉換等研究領域[8]，其中比較常見用于DNA檢測的固態納米孔是氮化硅納米孔和石墨烯納米孔。相比于生物納米孔，固態納米孔在穩定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優勢，但是因為受限于如今的半導體工藝制造水平，固態納米孔的制造還較為復雜與昂貴。三、納米孔測序的特點相比于其他測序平臺，納米孔測序作為一種新型測序技術在成本、速度、讀長和準確率等諸多方面有著不同的特點，其優勢十分顯著，主要可以概括為以下幾點：1.較長的測序讀長納米孔測序技術利用堿基穿過納米孔時電信號的改變實現測序，理論上可檢測通過納米孔的全部核酸序列，讀長長度僅受限于所測單鏈DNA的長度[9]。長度長可以提供更完整、更連續的基因組組裝，在具有大型結構變異和高水平重復區域的基因組中優勢顯著。2.可快速實時測序相比于其他傳統測序，納米孔測序真正意義上做到了動態實時測序，可邊測序邊輸出結果，用戶可以在測序早期了解樣本的質量和狀態，也可以在獲得足夠的數據后停止測序。同時納米孔測序技術所需的時長也是遠遠短于其他測序方法，節約了操作時間同時降低了測序成本。3.納米孔測序設備簡單便攜目前使用最成熟的MinION測序儀尺寸只有一支筆的長度，重量大約100g，長度僅10cm，可使用高速USB插入電腦，以其極小的體積徹底顛覆了人們對測序儀的印象，被稱為“Ｕ盤測序儀”[10]。因其便攜性，可在實驗室、野外甚至太空等各種復雜環境下完成實時測序，可保證對突發疫情處理的時效性。

4.可直接對RNA進行測序納米孔測序可以直接對各類原始DNA和RNA進行測序，不僅節省了時間和成本，完整地保留堿基修飾的信息，還能避免將RNA逆轉錄為DNA擴增所產生的偏向性及可能引入的突變。其文庫制備的工作流程也較為簡單。雖然納米孔測序的優點十分明顯，與前幾代技術相比在成本、速度方面有著很大優勢，但是目前還處在起步階段，從測序原理到制造工藝都存在有許多問題。首先，檢測準確度相對較低，這是納米孔測序發展過程中一直致力于解決的問題，除了通過優化納米孔和馬達蛋白外，還通過獨立研究開發的算法來解決準確度的問題。其次，檢測通量和文庫產量也限制了該技術的應用。目前仍然缺乏針對少量樣品的高產量文庫制備和測序規范流程。而且也并非總是能夠從臨床樣本中獲得足夠大且完整的高分子量DNA和全長RNA。讀取長度和產量之間仍需權衡。四、納米孔測序的應用納米孔測序有獨特的優勢：長度長，測序速度快，這讓它在某些場景中占有很大的優勢，但是通量偏低、價格高、準確度偏低也嚴重限制了它的應用場景。根據之前的分析，對讀長要求高，但是對序列數和準確度要求不高的應用場景才是納米孔測序的最適場景。1.大基因組拼接在以往基于短片段的基因組拼接中，由于一些動植物基因組本身具有多倍體，高度重復，高度雜合的特性，導致基因組拼接異常艱難。而納米孔測序技術具有長讀長的特點，利于大基因組的拼接，可以極大的提高基因組的完整性。2.全長轉錄組以往的轉錄組分析由于無法直接對RNA進行測序，往往需要先對mRNA進行打斷，再反轉錄為cDNA，無法獲取和分析全長轉錄本。納米孔的長讀長特點可以準確識別各基因的多個同源異構體，簡單準確；并且可以直接測序RNA，直接識別RNA的堿基修飾。3.大片段結構變異基因組上會產生很多與人類疾病相關的大片段結構變異（如缺失、倒位和易位等），短測序讀長無法準確檢測這些變異，而納米孔測序的讀長較長，適合進行大片段結構變異的檢測，在疾病研究等方面具有良好的發展前景。4.病原微生物快速鑒定[11]由于納米孔測序具有實時，快速的特點，可以在采集點直接進行測序，實時得到序列信息進行物種分類鑒定，完成病原微生物的快速鑒定。目前納米孔測序技術在傳染病、臨床感染病原快速檢測中的應用研究較為廣泛。五、結論與展望納米孔測序技術近年來發展迅猛，相比于其他測序技術，其憑借著超長讀長、實時監測、簡單便攜等特點開始被廣泛應用于各個領域，但是目前納米孔測序技術也不盡完美。目前國內外多家企業在研發準備申報相關單分子測序產品的過程中，主要集中在病原體檢測和腫瘤、遺傳病早篩等方向，后續我們會繼續關注相關產品的準確度、檢測通量及文庫制備的相關技術進展。

參考文獻：[1]SteinmannKE，HartCE，ThompsonJF，MilosPM.HelicosSingle-moleculeSequencingofBacterialGenomes[J].High-ThroughputNextGeneration

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