醫療器械生物學評價第23部分：刺激試驗國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會I V V 1 1 2 4 4 4 45.2.1基本考慮 4 5 55.2.4生物衍生材料 55.3化學組成方面的信息 55.3.1總體要求 55.3.2現有的數據來源 5 56.1總則 56.2體外重建人表皮模型 66.2.1試驗系統——重建人類表皮模型 66.2.2試驗原則 66.2.3預測模型 76.3材料 76.3.1重建人類表皮模型——產品說明 76.3.2醫療器械浸提液制備 76.4方法 86.4.1總則 86.4.2試驗步驟 86.4.3培養基和終點溶液 96.4.4試驗樣品和對照制備 96.5試驗的注意事項 6.5.2準備及預培養 Ⅱ6.6加樣和沖洗 6.6.1總則 6.6.3試驗浸提液及對照的接觸 6.7.1MTT培養和異丙醇萃取 6.7.2吸光度測量 6.8試驗接受準則 6.9數據計算步驟 6.9.2RhE試驗中OD測定的異丙醇背景對照 6.9.3DPBS或PBS處理的陰性對照 6.9.4陽性對照 6.9.5試驗浸提液和VC樣品(TTs) 6.11方法記錄單 7體內刺激試驗 7.2皮膚接觸的動物刺激試驗 7.2.2試驗材料 7.2.4試驗步驟 7.3皮內(皮膚內)途徑的動物刺激試驗 7.3.2應排除的試驗材料 7.3.3試驗樣品 7.3.5試驗步驟 8人體皮膚刺激試驗 8.1通則 22Ⅲ8.2初步考慮 附錄A(規范性)刺激試驗材料制備 附錄B(資料性)用重建人皮模型進行體外刺激試驗的試驗方法核對清單 25附錄C(資料性)重建人表皮模型的方法記錄表示例 27附錄D(規范性)特殊刺激試驗 附錄E(規范性)人體皮膚刺激試驗 附錄F(資料性)刺激試驗背景信息 49 V 第22部分：納米材料指南：M附錄A中給出了具體涉及以上試驗材料制備的說明 M ——第17部分：可瀝濾物允許限量的建立。目的是為醫療器械可瀝濾物允許限量的建立提供 1GB/T16886.1—2022醫療器械生物學評價第1部分：風險管理過程中的評價和試驗(ISOISO10993-1醫療器械生物學評價第1部分：風險管理過程中的評價與試驗(Biologitionofmedicaldevices—Part1:Evaluatiodevices—Part2:Animalwelfarerequirements)uationofmedicaldevices—Part9:FrameworkforidentificationandquantificatISO10993-12醫療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照材料(Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part12:Saologicalevaluationofmedicaldevices—Part13:Identifiuctsfrompolymericmedicationofmedicaldevices—Part14:Identif2ISO10993-15醫療器械生物學評價第15部分：金屬與合金降解產物的定性與定量(Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part15:IdentificationandquantificatISO10993-18醫療器械生物學評價第18部分：風險管理過程中醫療器械材料的化學表征(Bi-ologicalevaluationofmedicaldevices—Part18:Chemicalcharacterizationofmedicaldevicematwithinariskmanagementprocess)ISO14155用于人體的醫療器械臨床研究良好臨床規范(Clinicalinvestigationofmedicalde-vicesforhumansubjects—GoodOECD404急性皮膚刺激/腐蝕(AcuteDermalIrritatOECD439體外皮膚刺激：重建人表皮試驗法(InVitroSkinIrritation:ReconstructedHuman 空白blank3水腫oedema性的或反應性的應答。介質vehicle4現有檢測刺激的試驗方法特別設定為測定潛在的皮膚刺激和黏膜刺激作其他類型的不良作用(如致敏)。歷史上刺激試驗是在兔身上進行的。對于植對試驗結果表明，這些模型也能用于檢測常用于制造醫療器械的高分子材料[聚氯乙烯(PVC)和硅樹a)化學表征，需要時按照ISO10993-9、ISO10993-13、ISO10993-14、ISO10993-15和c)采用6.2～6.12中經驗證的RhE方法進行體外替代試驗；e)根據ISO14155和人體臨床研究的倫理原則，不應在通過a)～d)中所述的一項或多項評價5試驗前的考慮5.1總體要求GB/T16886.1—2022第5章規定的醫療器械分類要求和下列要求是適用的。非無菌樣品應僅通過局部試驗進行體內研究，因為試驗樣品微生物5.2材料類型5GB/T16886.23—2023/IS應性產物可能存在于終產品中。這些成分是否產生健康危險/風險取決于終產品的可瀝濾或降解性表征程度取決于對材料配方的了解程度以及人體與醫療器械接觸的性質和時間。療器械的組成化學物質以及制造過程中可能殘留的過程助劑或添加劑。化學成分可能的情況下應從原材料供應商處索取化學組成方面的定性與定量信息應按照ISO10993-18進行醫療器械的化學表征。6體外刺激試驗6.1總則用于測試刺激性的體外RhE模型是專為檢測純化學物皮膚刺激性而研發的(見OECD439)。此66.2體外重建人表皮模型RhE模型應含有正常人源表皮角質形成細胞，這種細胞經培養可形成多層高度分化的人表皮模層。從健康志愿者獲取的正常人角質形成細胞應在薄膜或濾紙上的氣液交界面(如生理鹽水)和非極性(如芝麻油)浸提液直接加至RhE模型的上表面。及后續紫色甲膜鹽的轉化，之后再將甲膜從組織中萃取出來后進行定量測定。處純化學物方案相比需延長接觸時間。在37℃接觸生物材料浸提液中潛在的低濃度刺激物培養不少于18h～24h的時間，足以通過組織活性降低50%以上預測體外刺激性。在采用醫療器械浸提液進行的加入試驗和對照浸提液后的組織在37℃、5%CO?的濕化培養箱培養。洗后將RhE組織表面吸干。將組織與MTT溶液在24孔板中(1mg/mL,300pL/孔)培養3h后評估活性。室溫條件下采用適量(取決于采用的RhE模型)異丙醇萃取甲胰結晶至少2h。從每塊RhE組織萃取的甲臘中取2份或3份(根據說明書)加入96孔板(200μL/孔)后測定570nm處的吸光度。對直接接觸試驗，分別用體積分數1%的溶于0.9%氯化鈉注射液的十二烷基硫酸鈉(SDS,見6.4.4)溶液作陽性對照(PCs),DPBS或不介質對照應包括已進行了ISO10993-12醫療器械浸提程序的生理鹽水(NaCl,0.9%)溶液和芝麻試驗樣品),還有化學物能直接將組織或細胞染色。只有在接觸過程結束時組織7GB/T16886.23—2023/IS考文獻[23]和[24]給出了測試可能與MTT相互作用的方案。使用特殊或適合的對照，在減去因直接化學性MTT還原和/或組織中浸提出的化學物殘留顏色導致的非特異性光密度(OD)值后，能計算出此預測模型是基于OECD439預測模型和在優化醫療器械方案過程中進一步獲得的數據。如果接觸后細胞活性≤50%:試驗樣品為刺激物(I)。如果接觸后細胞活性>50%:試驗樣品為非刺激物(NI)。顯示出陽性結果(活性≤50%),那么認為此醫療器械樣品有潛在的刺件會引起刺激反應。必要時，可考慮進行體內試驗進一步評價刺激反應的類型。為非刺激物(活性>50%),應認為器械或器械組件為非刺激物。6.3材料對基于醫療器械浸提液的試驗樣品，在一項大型國際比對試驗中評價了OECD439中描述的兩種RhE模型的應用。在這個試驗中使用了EpiDerm1“組織EPI-200模型和SkinEthicIMRhE模型2。已制定這些模型的具體方案作為補充材料。這兩個模型均已被歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)驗證用于測定化學物皮膚刺激并被OECD439和歐盟(EU)導則B.46收錄。出于分類和標識的目的，這些模型已用純工業化學物進行了驗證。如果經過醫療器械浸提液皮膚和組織刺激試驗驗證，OECD439中描述和驗證的其他模型也能用于醫一個新的用于體外皮膚刺激性試驗的RhE模型若要列入OECD439,應證明其預測能力和實驗室材料進行實驗室間(至少3個實驗室)的3輪(3個生產批號的RhE模型)盲法試驗。應按照ISO10993-12制備醫療器械和/或生物材料-——極性浸提液應在0.9%生理鹽水中制備(900mg加8——H341:懷疑會導致遺傳性缺陷(說明接觸途徑——如已確證無其他接觸途徑造成這一危險)。附錄B提供了使用重建人類表皮(RhE)模型進行體外刺激試驗的清單。應記錄RhE刺激試驗過程中所有操作。附錄C提供了方法記錄單(MDS)舉例。以下是進行體外——RhE組織到達前開始制備器械/生物材料試驗樣品的極性(生理鹽水)和非極性(芝麻油)浸提液。浸提開始時間宜基于按照ISO10993-12選擇的浸提時間和組織準備好進行處理的時間鹽水)溶劑中。在證明適宜性和陽性結果后，能使用較低濃度的SDS(如0.25%～0.5%)作為9--平板分光光度計讀取OD值。將3×100pL體積分別加入3塊單獨的RhE組織。應使用商品化的20%SDS溶液。—根據制造商的使用說明將盛有RhE組織的小室轉移-—所有組織加樣完成后，轉移所有培養板至濕化培養箱[(37±1)℃、(5±1)%CO?]培養至所需料。推薦沖洗15次～25次。若RhE模型制造商提供具體說明則遵照執行。沖洗不宜太輕---將組織表面吸干(如使用雙頭棉簽)。——轉移小室至適宜容器或預先加有新鮮測試培養基的(0.3mL/孔)組織培養板6.7用于測定接觸階段后RhE組織活性的MTT試驗6.7.1MTT培養和異丙醇萃取通過MTT還原測定法評估RhE組織活性。接觸結束后立即進行MTT測試。沖洗組織去除殘留——準備MTT培養基和加有測試培養基的24孔板或其他合適的培養板。將300μLMTT培養基(濃度為1mg/mL)加入所需數量的24孔板的各孔中。入300μLMTT的24孔板中。將培養板放入培養箱[(37±1)℃、(5±1)%CO?的濕化培養——密封容器或平板，或置于密封塑料袋中防止蒸發。記錄萃取開始時間(如在MDS中),用平板振蕩器以約120r/min的速率室溫輕輕振蕩萃取甲膜至少2h。也可選擇過夜萃取(18h~的溶液測吸光度。轉移萃取液至96孔板前用加樣器至少上下吹打3次至溶液均勻。 根據RhE供應商說明書，從每個試驗孔中轉移2份或3份200μL液體至平底96孔微量平板中(適當標記)。每次測定都應使用一塊96孔板。——根據制造商說明書，使用波長濾光片在96孔板分光光度計中讀取OD6.8試驗接受準則陰性對照和介質對照接受準則：如果3塊RhE組織在570nm的平均OD值滿足≥0.7且<3.0,NC和VC數據通常符合接受準則。這些值是不同RhE模型的最大和最小OD值，它們的不同取決于RhE供應商的說明書(見OECD439)。OD值應符合OECD439中指定的各個模型的接受準則。如果NC或VC培養后的3塊RhE組織的平均活性標準差≤20%,OD值就是有效的。VC的組織平均活性應為NC的80%～120%范圍內。陽性對照接受準則：如果平均活性(以NC的%表示)<40%,平行RhE組織活性的標準差≤20%,則試驗樣品數據接受準則：如果試驗樣品培養后RhE組織的平均活性標準差≤20%,則認為數據有6.9數據計算步驟6.9.2RhE試驗中OD測定的異丙醇背景對照計算每板6個異丙醇復孔的平均OD值。計算各RhE組織OD值間的標準差。將DPBS或PBS處理的陰性對照的OD值減去異丙醇背景的平均OD,計算異丙醇背景校正值。計算每塊RhE組織平均OD值(3個重復)。所有RhE組織的平均OD值相當于100%活性。計算各RhE組織間OD值及活性的標準差。-—將陽性對照的OD值減去異丙醇背景的平均OD,計算異丙醇背景校正值。GB/T16886.23—2023/IS——計算每塊RhE組織平均OD值(3個重復)。——用PC各RhE組織的平均OD值除以NC各RhE組織的平均OD,再乘以100,計算每塊RhE——計算各RhE組織間OD值及活性的標準差。6.9.5試驗浸提液和VC樣品(TTs)-—將試驗浸提液的OD值減去異丙醇背景的平均OD,計算異丙醇背景校正值。-—計算每塊RhE組織平均OD值(3個重復)。-—用TT各RhE組織的平均OD值除以NC各RhE組織的平均OD,再乘以100,計算每塊RhE——計算所有RhE組織平均活性。——計算各RhE組織間OD值及活性的標準差。計算每塊處理表皮相對于陰性對照平均值的活性百分比。也應計算出變異模型用3塊RhE組織的平均相對活性進行分級。根據接觸于樣品組織的平均組織活性預測試驗樣品潛在刺激性。計算3塊組織的平均活性。若平均相對活性≤陰性對照的50%,則預測出現刺激反應。對采用極性(如生理鹽水)和非極性(如芝麻油)溶劑浸提的醫療器械或醫療器浸提液顯示對組織的陽性作用(活性≤50%且標準差<20%)則應認為此試驗器械或器械組件有刺激性(見表1)。如果兩種溶劑的結果均是非刺激物(活性>50%),則應認為此器械或器械組件為非刺激物。體外解釋準則分級刺激性(I)非刺激性(NI)6.11方法記錄單-—試驗材料或器械的描述； --結果評估及試驗樣品或器械分級；---試驗日期。--用于評價試驗的技術。內在動物背部除去被毛。宜在脊柱兩側足夠的距離除去背毛，以便試驗和觀察所有試驗部位(約5將相應的浸提液滴至2.5cm×2.5cm大小的吸水性紗布塊上，浸提液的用量以能浸透紗布塊為宜，一般每塊紗布滴500pL,按圖1所示部位敷貼于動物背部兩側。按圖1所示將滴有浸提介質的紗用繃帶(半封閉性或封閉性)覆蓋敷貼部位至少4h。接觸期結束后取下敷貼片，用非皮膚刺激性要時可研成粉末),應使用水或必要時選擇一種替代溶劑將試驗材料充分濕化用2.5cm×2.5cm的非封閉性敷料(如紗布塊)對接觸部位進行標記。用適當的方法除去殘留試驗材料，如用溫水或其他適宜的特別推薦在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應。按表2給出的記分系統描述每一接觸部位在0極輕微紅斑(勉強可見)12中度紅斑34無水腫0極輕微水腫(勉強可見)1清晰水腫(腫起邊緣清晰)2中度水腫(腫起約1mm)3重度水腫(腫起超過1mm,并超出接觸區)48為3)。中度---觀察記錄；--使用的標準(包括其出版年份);-觀察到的任何異常表現；用1只動物。除非出現明顯的陽性反應[紅斑或水腫記分大于2(見表4),圖2注射點排列7.3.6動物觀察注射后即刻并在(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h觀察記錄各注射部位狀況。按表4給出的記分系統對每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應評分，并記錄試驗結果。在(72±2)h觀察時，可靜脈注射適宜的活體染料，如臺盼藍或伊文思藍，以顯示出刺激區域有助于反應評價。表4皮內(皮膚內)反應記分系統0極輕微紅斑(勉強可見)12中度紅斑34無水腫0極輕微水腫(勉強可見)1清晰水腫(腫起邊緣清晰)2中度水腫(腫起約1mm)3重度水腫(腫起超過1mm,并超出接觸區)48部紅斑與水腫記分相加，再除以15[3(記分時間點)×5(試驗樣品或空白對照注射點)],計算出每只動物試驗樣品或空白對照的記分。3只動物記分相加后除以3得出每一試驗樣品和相應空白對照的總平均記分。試驗樣品記分減去空白對照記分能得出試驗樣品最終記分。如試驗樣品最終記分不大于1.0,則符合該試驗要求。如果動物之間的結空白對照樣品為圖2中提及的極性或非極性溶劑對照。---試驗材料或器械的描述；-—試驗材料或器械的預期用途/應用；-—制備試驗樣品或試驗材料所用方法的詳細描述；—-注射方法；-—觀察記錄；-—觀察到的任何異常表現； 臨床試驗應按ISO14155的規定進行。附錄E中給出了臨床試驗其他特殊8.2初步考慮c)根據結構-活性關系和/或物理化學特性如強酸或強堿余量e)在試驗條件下材料產生任何急性毒性危險；GB/T16886.23—2023/IS(規范性)A.1總體要求和條件等因素，對這些試驗最關鍵的因素之一就是試驗材料的制備。本附錄提供了體外和體內刺激試驗樣品制備的一般信息。各種類型的試驗樣品的適用性和使用情況在本文件的相關條款中進行A.2.1固體試驗材料有一定適宜物理形態的固體材料(如片材和薄膜)應不加改變直接用于試驗。可制成2.5cm×A.2.2液體試驗材料A.3試驗材料浸提液A.4溶劑如果最終產品以無菌狀態提供，試驗前則應采用相同程序對試驗材(資料性)——在組織到達前(通常在RhE組織到達前48h～72h,取決于RhE組織預培養的需要)在極性(生理鹽水)和非極性(芝麻油)溶劑中制備醫療器械試驗和對照樣品浸提應根據ISO10993-12進行論證。理鹽水)溶劑。在證明適宜性和陽性結果后，能使用較低濃度的SDS(例如0.25%～0.5%)作——使用DPBS或PBS沖洗中止接觸。---—準備MTT溶液和MTT培養板。——將組織轉移至MTT溶液中。——將MTT中組織在(37±1)℃、(5±1)%CO?的濕化培養箱中培養3h±5min。--—將萃取液轉移至96孔板中。-—用平板分光光度計讀取OD值。上述檢查表也見于表B.1。時間制備極性和非極性浸提液(37±1)℃根據制造商的說明預培養組織(例如2h～24h)在(37±1)℃、(5±1)%CO?的濕化培養箱中培養過夜(如18h~24h,取決于制造商)GB/T16886.23—2023/ISO10993-表B.1用重建人表皮模型進行體外刺激試驗的程序(續)時間活性測定將組織轉移至MTT溶液中將組織轉移至MTT溶液中MTT培養在(37±1)℃、(5±1)%CO?的濕化培養箱中培養組織3h±5min甲臘檢測甲膜萃取甲臘萃取后振蕩并均質化將甲膜萃取液轉移至96孔板中(資料性)……相應的XLS數據文件名：表C.1時間方案時間結束結束試劑性能信息見表C.2。表C.2試劑性能信息重建表皮(RhE)供應批號：MTT濃縮液批號：MTT稀釋劑批號：表C.2試劑性能信息(續)異丙醇(MTT萃取劑)批號：12——邊緣缺陷；使用分數：1——非常好；2———好；3———可接受 —pH調整(至7.0):.. 表C.4單個組織的記錄記錄樣品在96孔板上的位置。嚴格按照生產商說明書上所示的固定的平板設計。用于醫療器械刺激試驗比對研究[9]中所用的平板布局示例見表C.5和表C.6。表C.5EpiDermRhE模型組織1組織2組織3bckg:異丙醇溶液用于本底測量；NC:陰性對照[(D)PBS];PC:陽性對照[(SDS生理鹽水(PC)];VC:介質對照背景[如生理鹽水(VC1)和芝麻油(VC2)];TA1、TA2、…、TA7:試驗樣品1～7。根據制ABCDEFGHABCDEFGH組織1PCNACL:NaCl浸提介質陽性樣品對照；PCSO:芝麻油浸提介質陽性樣品對照。NaCl1和SO1,試驗樣品1每塊培養組織3份200μL異丙醇萃取液。額外的測試樣品能在額外的96孔板中測表C.8樣品制備及培養放入時間取出時間浸提前和(規范性)存在以下特殊刺激試驗。這些試驗與預期應用于特定部位的醫療器械具有相D.2眼刺激試驗D.2.1總則眼刺激試驗只有在用其他方法不能得到安全關于急性眼刺激/腐蝕的OECD405描述了一種逐步的體內測試策略，以確定化學品的眼睛刺激/腐蝕性能。使用這種策略以及證據權重分析(在進行體內試驗之前考慮所有關可用信息)對于避免不必要的動物使用是很重要的。減少導致嚴重動物反應的物質試驗促進動物福利和健全的科學。雖然TG405是一種體內試驗方法，但它在動物試驗的減少和優化方面也支持3R原幾種眼刺激體外替代試驗已被評價。然而，它們尚未被驗證可用試驗方法的策略性組合能夠替代德萊塞(Draize)眼試驗。在EURLECVAM工作組內，闡述了關于化學品(分層)測試策略的一個基本概念。該框架基于檢測嚴重刺激物質(EUR41;GHS“第1類”)或非經過驗證[通過替代方法驗證部門間協調委員會(ICCVAM)、EURLECVAM、日本替代法驗證中心(JaCVAM)或其他]的體外試驗。這些指南描述了牛角膜混濁和滲透性測試方法(見OECD437),離體雞眼試驗法(見OECD438),使用在半透性插入物上生長的細胞進行熒光素泄漏試驗的方法(見OECD460)和由基于細胞毒性在融合的單分子層兔角膜上皮(SIRC)細胞上進行的體外試驗組成的體外短時間接觸試驗方法(見OECD491),以及使用人重建角膜樣上皮的試驗，即所謂重建人類角膜樣上皮D.2.5試驗材料試驗材料如是液體，將100μL未稀釋液直接滴入動物1只眼的下結膜囊內。試驗材料如是固體或顆粒狀制品，將其研磨成細粉，混合后取100μL體積容量(質量不超過100mg)滴入動物1只眼的下結膜囊內。初試應使用1只動物評價試驗材料。如1只動物出現清晰的陽性反應(見表D.1)時，則不必再進固體或液體材料如沒有出現反應時(見表D.1),應至少再使用2只動物進行試驗。對于浸提液，每種浸提液也應至少再使用2只動物。D.2.7試驗步驟在試驗開始前24h內，目視檢查每只兔子的雙眼，判斷是否有眼部異常的情況。如果任何1按D.2.5的規定將試驗樣品滴入動物的1只眼內。接觸試驗應只在急性接觸試驗完成后[至少在(72±2)h后]進行，接觸周期宜與試驗材料/器械臨床使D.2.8動物觀察按表D.1規定的眼損傷記分系統，對觀察到的反應記分1)渾濁程度(最致密區域):透明0云翳或彌散混濁區，虹膜細節清晰可見易識別的半透明區，虹膜細節略顯模糊乳白色區，看不見虹膜細節，幾乎不能辨別瞳孔大小2)角膜受累范圍0大于1/4,小于1/21231)正常0超出正常皺襞，充血水腫，角膜緣充血(其中一種或全部(反應遲鈍為陽性)無對光反射，出血性嚴重結構破壞(其中一種或全部)1)充血(累及瞼結膜和球結膜，不包括角膜和虹膜)01彌散性充血，呈深紅色，血管紋理不清2)水腫GB/T16886.23—2023/IS表D.1眼損傷記分系統(續)無水腫0輕微水腫(包括瞬膜)1明顯水腫伴部分瞼外翻眼瞼水腫使眼呈半閉合狀眼瞼水腫使眼呈半閉合乃至全閉合狀0超過正常分泌量(不包括正常動物眼內眥少量分泌物)123-—有血污或膿液排出；——對光反射消失(虹膜反應記分2)或角膜渾濁(記分4),并在(2-—重度結膜炎(結膜水腫記分4,并伴發充血記分3),并在(48±2)h內無可逆跡象。D.2.9.1總體要求試驗眼與對照眼之間的差異性應按表D.1給出的記分系統進行判定并解釋。如果有1只以上動物試驗眼在任何觀察階段呈現陽性結果(見表D.1),即認為該材料為眼刺激如3只動物試驗眼中僅有1只呈輕度或中度反應或是疑似反應，另取動物進行復試。復試中如動物試驗眼在任何觀察階段半數以上呈現陽性結果(見表D.1),則認為該試驗材料為眼僅有1只動物出現嚴重反應已足以標示該材料為眼刺激物。D.2.10試驗報告--—使用的標準(包括其出版年份);---試驗樣品的預期用途/應用； --結果評估；D.3口腔黏膜刺激試驗D.3.1總體要求數據的情況下才考慮進行。與體外重建人表皮模型類似，現在也有黏膜體外D.3.3應排除的試驗材料任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.D.3.5動物與管理初試應至少使用3只動物評價試驗材料。D.3.6試驗步驟D.3.7動物觀察描述動物頰囊的一般狀況，并按表D.2給出的記分系統判定動物每一觀察期頰囊表面紅斑反應記表D.2黏膜反應肉眼記分系統0極輕微紅斑(勉強可見)12中度紅斑34D.3.8.1肉眼評價D.3.8.2組織學評價應由病理學家對口腔組織顯微鏡下的刺激作用進行評價，可按表D.3給出的記分系統對每一組織算。最大記分為16。對照頰囊或對照動物的顯微鏡評價總分大于9時可能表明有病理改變，可能是試驗操作時造成的正常，完好無損01234白細胞浸潤(每個高倍視野)無0極少(少于25)1輕度(26～50)2中度(51～100)3重度(大于100)4無012中度34水腫無012中度340中度宜記錄組織的其他不良改變，并包括在反應的評估中D.3.9試驗報告-—試驗樣品的描述；-—制備試驗樣品所用方法的詳細描述；---實驗動物的描述； ——使用的國家標準(包括其出版年份); D.4.1總體要求D.4.3應排除的試驗材料任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不應再進行試驗，應標示為潛在的D.4.4試驗樣品D.4.5動物與管理應使用雄性白化兔或豚鼠。使用健康初成年體重不低于2kg的兔和體重為300g～500g的豚鼠。應使用出現嚴重變色或紅斑記分大于或等于2的動物。初試應至少使用3只動物評價試驗材料，另取3只動物作為對照組。D.4.6試驗步驟D.4.7動物觀察急性接觸時，每次接觸后(1±0.1)h(如下次接觸前立即)注意觀察陰莖外觀。末次接觸后(1士按表D.2給出的記分系統對每一動物每一觀察期皮膚表面紅斑反應記分，并記錄結果以出具試驗樣品引起的紅斑記分。每一觀察記分最高為4分。將每次觀察記分(見表D.2)相加后再除以觀察次數得出每只動48h觀察后立即將動物人道處死。切下陰莖和包皮末端放入適宜的固定劑中固定后進行組織學D.4.8.2組織學評價應由病理學家對陰莖皮膚的刺激作用進行評價，病理學家可根據表D.3給出的系統對每個組織進為16。對照動物出現顯微鏡評價總記分大于9時，表明可能有操作損傷。如其他試驗或對照動物顯示同試驗組平均記分減去對照組平均記分即得出刺激指數(見表D.4)。D.4.9試驗報告——使用的國家標準(包括其出版年份);--觀察記錄；-—結果評估：D.5.1總體要求直腸刺激試驗應僅考慮用于預期與直腸組織接觸的材料，并且只有在用D.5.3應排除的試驗材料任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.固體或液體試驗材料應按附錄A的規定進行制備。D.5.5動物與管理應使用健康、初成年的白化兔，雌雄不限，同一初試應至少使用3只動物評價試驗材料，另取3只動物作為對照組。D.5.6試驗步驟將一短軟管(6cm)或一鈍頭插管與一容量大于物1mL試驗樣品。應為每只動物分別準備1套注射器和連接導管。提起動物尾巴暴露出會陰，然后將濕化處理過的導管輕柔地插入直腸，用注射器注入1mL試驗D.5.7動物觀察D.5.8.2組織學評價應由病理學家對直腸組織的刺激作用進行評價，病理學家可根據表D.3給出的系統對每個組織進為16。對照組動物出現顯微鏡評價總分大于9時，表明試驗操作中可能造成損傷。如其他試驗或對照動試驗組平均記分減去對照組平均記分即得出刺激指數(見表D.4)。 --接觸方法；-—試驗位點記分是如何進行的；---觀察記錄；D.6陰道刺激試驗D.6.1總體要求D.6.3應排除的試驗材料任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.初試應至少使用3只動物評價試驗材料，另取3只動物作為對照組。物1mL試驗樣品。應為每只動物分別準備1套注射器和連接導管。每次間隔(24±2)h重復上述步驟，至少連續5d。其他處理方案(如基于臨床使用)應進行論證并D.6.7動物觀察對于出現過度溢液、紅斑和/或水腫情況，或難以給藥的動物，應無痛處死后做組織學檢查(見D.6.8.1和D.6.8.2)。D.6.8結果評價將取下的陰道組織放入適當的固定劑中固定后進行組織學檢查。每塊陰道組織D.6.8.2組織學評價應由病理學家對陰道組織的刺激作用進行評價，病理學家可根據表D.3給出的系為16。對照組動物出現顯微鏡評價總分大于9時，表明試驗操作中可能造成損傷。如其他試驗或對照動試驗組平均記分減去對照組平均記分即得出刺激指數(見表D.4)。D.6.9試驗報告--—使用的國家標準(包括其出版年份);---試驗樣品的描述；-—試驗樣品的預期用途/應用；-—制備試驗樣品所用方法的詳細描述；---試驗位點記分是如何進行的；---觀察到的任何異常表現；E.1總則E.3.3.1志愿者人數0微弱陽性反應(輕微紅斑和/或接觸區域大面積干燥)1中度陽性反應(明顯的紅斑或干燥，可能超出接觸區)2重度陽性反應(重度及擴散性紅斑伴水腫和/或焦痂形成)31)物理性質和相關的理化特性；2)識別數據。3)對觀察到的所有刺激反應的描述；4)對觀察到的其他非刺激反應的描述；GB/T16886.23—2023/IS5)結果的統計學處理(與陽性對照的對比，如用Fisher's試驗);g)使用的國家標準(包括其出版年份)。j)試驗日期。SDS接觸用于測定志愿者并作為一個參照點。按照歐盟準則(88/379/EEC,1988年6月7日的一個區域性組織(歐盟)將20%(質量濃度)的SDS水溶液看作明顯的急性皮膚刺激物。見參考文獻驗的方法(見OECD460)和由基于細胞毒性在融合的單分子層兔角膜上皮(S[5]AgnerT.,Noninvasivemeasuringmettions.Astudyofpatientswithhandeczema,atopicdermatitisaVenereol.Suppl.(Stockh.).1992,173pp.1-26[6]AlépéeN.,TornierC.,RobertC.,AmsellemC.,Rouxupvalidationstudyonreconstructedhumanepidermis(SkinEthicIMRhE)forfullreplacementoftheDraizeskinirritationtest.Toxicol.In[7]CasasJ.W.,LewerenzGJ.M.Jretal.,InVitroHumanSkinIrritationTestforEvaluationofToxicol.InVitro.2013,27p[8]ColemanK.P.,GrailerT.P.,McNamaraL.R.,RollinsB.L.,ChH.etal.,Preparationofirritantpolymersamplesforaninvitroroundrobinstudy.ToVitro.2018,50pp.401[9]DeJongW.H.,HoffmannS.,LeeM.,Kanskinirritationtestfordetectionofirritant[10]DraizeJ.H.,WoodandG.,CalveryH.O.(1944),Methodsforthestudyofirtoxicityofsubstancesappliedtopicallytotheskinandmucousmembranes.J.Pharmacol.Exp.Ther.1944,82pp.[11]DraizeJ.H.AppraisalofthesafetyofAustin,Texas,AssociationoffoodanddrugofficialsoftheUnitedStates,TexasStateDepartmentof[12]FallerC.,BracherM.,DamiN.,RoguetR.,Predictiveabilityofreidermisequivalentsfortheassessmentofskinirritationofcosmetics.Toxpp.557-572[13]Hagi-PavliE.,WilliamsD.M.,RowlandJ.L.,ThornhillM.,Cruchleyithelialmodel.FoodChem.Toxicol.2014,74pp.139-148patchtestingtopredictskinirritationofcommercialtopicaldrugs.J.Dermatol.2015,42pp.[15]KandarováH.,HaydenP.,KlausnerM.,KubilusJ.,KearneyP.,Sh(2009),InVitroSkinIrritationTest:ImprovingtheSensitivity[16]KandarovaH.,WilloughbyJ.A.,DeJongW.H.,M.A.etal.,Pre-validationofantedhumantissuemodelEpiDermTMToxicol.[17]KandárováH.,BendovaH.,LetasiovaS.,ColemanvaluationofthemedicaldevicesbenchmarkmaRhEinvitroskinirritationprotocol.Toxicol.InVitro.2018,50[18]LeeC.H.,MaibachH.I,The[19]Mosmannproliferationandcytotoxicityassays.J.Immunol.Methods[20]OlsenD.S.,LeeM.,TurleyA.P.,Assessmentoftestmethodvariablesforinvitroskinirritationtestingofmedicaldeviceextracts.Toxicol.InVitro.2018,50pp.426-432.[21]PellevoisinC.,TornierC.,BremondC.,RollinsB.,Brritationofmedicaldevices:InvitroassaywithEPISKINreconstruicol.Lett.2016,258([22]PellevoisinC.,VideauC.,BriotetD.,GregoireC.,TorniernEthicTMRhEforinvitroevaluationofskinirritatioVitro.2018,50pp.419-[23]SOPofinvitroskinirritatiSA,Lyon(France),Availableat/~/media/Files/SOP-SkinEthic-RhE-Ir-ritation-Medical-devicesCorporation'sReconstructedHumanEpidermalModel0023.Availableathttps://tocol-201603010.pdfhttps://www.mattek.com/wp-content/uploads/EPI-200-SIT-Skin[25]NomuraY.,LeeM.,FukuiC.,WatanabeK.,OlsenD.,TurKawakamiT.,YubaT.,FujimakiH.,InoueK.,YoshidaM.,OgawaK.,HaishimaY.,ProofofconcepttestingofapositiveMaterResBApplBiomater,201[26]ScottL.,EskesC.,HoffmannS.,Adriaenapproaches.Toxicol.InVitro.2010,24pp.1[27]WahlbergJ.E.,WahlbergE.N.,QtactDermat.1987,17pp.229-233[25]WahlbergJ.E.,MailbachH.I,Nonanoicacidpositivecontrolatroutinepatchtesting?ContactDermat.1980,6pp.128-130[28]WahlbergJ.E.patchtesting?ContactDermat.1980,6pp.128-130[29]WaltersR.M.,KhannaP.,HamiltonM.,MaysD.A.,TelofskiL.,HumanIrritationTestsofCommonPreservativesUseofOver45000Subjects.Toxicol.Sci.2015,148pp.101-107[30]YorkM.,GriffithsH.A.,WhittleE.etal.dentificationandclassificationofskinirritationpotential[31]EuropeanChemicalIndustryEcologyandToxicology