ICS07.080

A20/39

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T╳╳╳╳-201╳

瓊脂糖分離介質(zhì)

Agarose-basedchromatographicmedium

（征求意見(jiàn)稿）

200×-××-××發(fā)布200×-××-××實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

1

2

瓊脂糖分離介質(zhì)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了瓊脂糖分離介質(zhì)的技術(shù)要求、檢測(cè)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和

貯存。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于骨架為瓊脂糖微球的分離介質(zhì)的生產(chǎn)與檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本

適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備

GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備

3術(shù)語(yǔ)與定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1瓊脂糖分離介質(zhì)agarose-basedchromatographicmedium

瓊脂糖分離介質(zhì)是以瓊脂糖為主要原料制備得到的一類層析介質(zhì)。

4技術(shù)要求

4.1外觀

在光學(xué)顯微鏡下球形飽滿，表面光滑，透明性良好。

4.2理化性質(zhì)

瓊脂糖分離介質(zhì)的理化性質(zhì)應(yīng)符合表1中的規(guī)定。

3

表1瓊脂糖分離介質(zhì)技術(shù)要求

技術(shù)指標(biāo)

檢驗(yàn)項(xiàng)目

4%瓊脂糖分離介質(zhì)6%瓊脂糖分離介質(zhì)FF

粒度范圍/(45~165μm)(24~44μm)(45~165μm)(24~44μm)

%≥90≥90≥90≥90

平均粒徑（μm）97.5±12.534.00±695.5±14.535.5±11.5

在0.1Mpa壓力下可達(dá)最高流

≥210≥60≥270≥60

速*（cm/h）

固含量（%）7.50±1.6010.50±2.00

Mp=200000.59-0.660.61-0.680.48-0.530.54-0.59

分配系數(shù)Kav

Mp=500000.64-0.710.66-0.730.69-0.770.75-0.83

（葡聚糖）

Mp=100000.79-0.880.79-0.870.72-0.800.77-0.85

非特異性吸附

≤18≤18≤18≤18

（μg細(xì)胞色素C/mL介質(zhì)）

微生物污染

<100<100

（菌落數(shù)/mL懸浮液）

化學(xué)穩(wěn)定性pH3.0≤0.21≤0.21≤0.35≤0.35

（脫落物羥甲

基糠醛測(cè)pH13.0≤0.17≤0.17≤0.17≤0.17

定，%）

*：層析柱Φ1.60cm×20.00cm(介質(zhì)床層高度10.00cm),溫度22℃（±3℃）,溶液為H2O的

條件下測(cè)定。

5試驗(yàn)方法

本方法中所用的水，在未注明其他要求時(shí)，應(yīng)符合GB/T6682中二級(jí)水的規(guī)格，所用試

劑，在未注明其他規(guī)格時(shí)，均指分析純（AR）。

5.1外觀

5.1.1儀器

5.1.1.1光學(xué)顯微鏡。

5.1.1.2真空泵：極限真空0.1MPa。

5.1.2測(cè)定步驟

5.1.2.1樣品處理

4

用量筒量取5mL瓊脂糖白球，置于50mL砂芯漏斗中。用三級(jí)水清洗5次每次2min，

抽干5min。將洗凈的瓊脂糖白球置于燒杯中，瓊脂糖白球上應(yīng)有2cm的三級(jí)水。混勻后得

到瓊脂糖白球與水的混合體系。

5.1.2.2樣品觀測(cè)前處理

用塑料吸管吸取1mL瓊脂糖白球與水的混合體系置于載玻片上，調(diào)整顯微鏡放大倍數(shù)。

以視野里80%以上面積均為白球?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，用塑料吸管增減載玻片上的微球，最后用蓋玻片

壓上。

5.1.2.3樣品觀測(cè)

調(diào)節(jié)光學(xué)顯微鏡焦距，使視野中的影像清晰。拍攝瓊脂糖白球照片并保存。

5.2粒徑及其分布

5.2.1儀器

5.2.2.1激光粒度儀。

5.2.2.2塑料吸管。

5.2.2.3玻璃濾瓶。

5.2.2.4砂芯漏斗（G3）。

5.2.2.5真空泵：極限真空0.10MPa。

5.2.2測(cè)定步驟

5.2.2.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.2.2.2樣品檢測(cè)

設(shè)置測(cè)量顆粒類型為通用型，分散劑類型為水，分析模式為單峰模式，添加樣品進(jìn)行測(cè)

定。

5.2.4結(jié)果表示

通過(guò)激光粒度儀的檢測(cè)結(jié)果包括平均粒徑值及其分布圖，根據(jù)粒徑分布（如圖1中表格）

按公式（1）計(jì)算45-165μm粒徑范圍內(nèi)微球數(shù)量所占百分比。

5

……（1）

式中：

W粒徑——45-165μm粒徑范圍內(nèi)微球數(shù)量所占百分比，單位是%；

W1，W2，……Wx——符合45-165μm范圍的各粒徑范圍百分比，例如圖1中45.709

μm-52.481μm的球所占百分比為5.35%。

圖1瓊脂糖分離介質(zhì)粒徑分布圖

平均粒徑的計(jì)算方法：

其中dBk為單個(gè)介質(zhì)的粒徑，為所統(tǒng)計(jì)的一定數(shù)量介質(zhì)顆粒的平均值，N為

所統(tǒng)計(jì)的介質(zhì)顆粒的數(shù)目。

5.2.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)平均值的5%。

6

5.3耐受壓力強(qiáng)度測(cè)試

5.3.2儀器

5.3.2.1中低壓層析系統(tǒng)。

5.3.2.2玻璃層析柱：Φ1.60cm×20.00cm。

5.3.2.3玻璃濾瓶。

5.3.2.4砂芯漏斗（G3）。

5.3.2.5真空泵：極限真空0.10MPa。

5.3.3測(cè)定步驟

5.3.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.3.3.2樣品裝柱

將介質(zhì)與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩(wěn)定（Φ1.60

cm×10.00cm），柱子上端充滿水。打開(kāi)柱子入口，連續(xù)向柱中通入三級(jí)水（10個(gè)柱體積），

保持床層穩(wěn)定。

5.3.3.3樣品測(cè)定

將層析柱連入中低壓層析系統(tǒng)。測(cè)定時(shí)，從零開(kāi)始設(shè)定一定流速Vx（mL/min），保持

該流速5min后，記錄此時(shí)柱壓Px(MPa)。繼續(xù)增加流速，并測(cè)定相應(yīng)流速下的柱壓。直到

壓力達(dá)到0.10Mpa為止。

5.3.4結(jié)果表示

按公式（3）計(jì)算線速度。以線速度（V）與壓力（Px）之間的關(guān)系作圖，由圖讀取最

大流速（如圖2）。

…………（3）

式中：

V——線速度（cm/h）；

Vx——流速（mL/min）；

S——層析柱截面積（cm2）。

7

圖2瓊脂糖分離介質(zhì)壓力-流速曲線

5.3.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)平均值的10%。

5.4固含量

5.4.1儀器

5.4.2.1分析天平：精度0.1mg。

5.4.2.2離心機(jī)：0–4000r/min（可調(diào)）；50mL玻璃離心管（底部帶有G3砂芯篩板）4

支。

5.4.2.3玻璃濾瓶。

5.4.2.4砂芯漏斗（G3）。

5.4.2.5架盤天平：精度0.1g。

5.4.2.6稱量瓶：Φ50mm×30mm。

5.4.2.7干燥器：Φ250mm，內(nèi)放硅膠干燥劑。

5.4.2.8烘箱：溫度波動(dòng)±2℃。

5.4.2.9真空泵：極限真空0.10MPa。

5.4.3測(cè)定步驟

8

5.4.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.4.3.2樣品稱量

將5mL瓊脂糖分離介質(zhì)與水的混合體系裝入離心管內(nèi)，置于離心機(jī)，在2000r/min下

離心5min。取出離心管，將樣品小心倒入稱量瓶?jī)?nèi)，蓋嚴(yán)。在已恒重的兩個(gè)稱量瓶中分別

稱入上述稱重白球樣品（1.0-1.5g），精確至0.1mg。

5.4.3.3樣品烘干稱量

將稱量瓶開(kāi)蓋置于烘箱中，于105±2℃干燥4h至恒重。將稱量瓶蓋嚴(yán)，取出置于干燥

器內(nèi)，冷卻30min至室溫，稱量。

5.4.4結(jié)果表示

瓊脂糖分離介質(zhì)固含量按公式（4）計(jì)算：

G-G

W＝2′100………………（4）

G1-G

式中：

W——固含量（%）；

G1——干燥前稱量瓶加試樣質(zhì)量（g）；

G2——干燥后稱量瓶加試樣質(zhì)量（g）；

G——稱量瓶質(zhì)量（g）。

5.4.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)平均值的5%。

5.5分配系數(shù)Kav

5.5.1試劑

5.5.1.1葡聚糖：Mp=200000；Mp=50000；Mp=10000。

5.5.1.7BufferA(50mMPB-0.15MNaCl，pH7.0)緩沖液：稱取10.93g磷酸氫二鈉、3.04g

磷酸二氫鈉和8.76gNaCl，加水溶解，調(diào)pH7.0，最后定容至1000mL。

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5.5.2儀器

5.5.2.1中低壓層析系統(tǒng)。

5.5.2.2玻璃層析柱：Φ1.00cm×40.00cm。（柱子長(zhǎng)度再修改下）

5.5.2.30.45μm過(guò)濾膜。

5.5.2.4玻璃濾瓶。

5.5.2.5砂芯漏斗（G3）。

5.5.2.6真空泵：極限真空0.10MPa。

5.5.3測(cè)定步驟

5.5.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.5.3.2樣品裝柱

將介質(zhì)與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩(wěn)定（Φ1.00

cm×30.00cm，柱體積24.00mL），柱子上端充滿水。將層析柱介入中低壓層析系統(tǒng)，連續(xù)

向柱中通入三級(jí)水（10個(gè)柱體積），同時(shí)保證柱壓為0.3Mpa，保持床層穩(wěn)定。

5.5.3.3樣品測(cè)定

以BufferA溶液平衡，流速為2mL/min，先以1%濃度丙酮測(cè)定內(nèi)水相體積Vi，再將不

同分子量的葡聚糖單獨(dú)上樣，依次是葡聚糖Mp=200000；葡聚糖Mp=50000；葡聚糖

Mp=10000，樣品濃度2mg/ml。上樣量200μL。其中葡聚糖Mp=2000000測(cè)定外水相體積

Vo。

5.5.4結(jié)果

根據(jù)公式（5）計(jì)算分配系數(shù)Kav。

………………（5）

式中：

Ve——各樣品的洗脫體積（mL）

Vi——內(nèi)水相體積（mL）

Vo——、外水相體積（mL）

10

5.5.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)平均值的10%。

5.6非特異性吸附

5.6.1試劑

5.6.1.6細(xì)胞色素C：純度≧98%。

5.6.1.7BufferA(10mM醋酸銨，pH4.1)緩沖液：稱取0.77g醋酸銨，加水溶解，調(diào)pH4.1，

最后定容至1000mL。

5.6.1.8BufferB(50mMPB-0.15MNaCl，pH7.0)緩沖液：稱取10.93g磷酸氫二鈉、3.04g

磷酸二氫鈉和8.76gNaCl，加水溶解，調(diào)pH7.0，最后定容至1000mL。

5.6.1.9細(xì)胞色素C溶液（4mg/mL）：稱取10mg細(xì)胞色素C溶于10mLBufferA，上樣

前經(jīng)0.45μm過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

5.6.2儀器

5.6.2.1中低壓層析系統(tǒng)。

5.6.2.2玻璃層析柱：Φ1.60cm×20.00cm。

5.6.2.30.45μm過(guò)濾膜。

5.6.2.4玻璃濾瓶。

5.6.2.5砂芯漏斗（G3）。

5.6.2.6真空泵：極限真空0.10MPa。

5.6.3測(cè)定步驟方法

5.6.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.6.3.2樣品裝柱

將介質(zhì)與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩(wěn)定（Φ1.60

cm×5.00cm，柱體積10.00mL），柱子上端充滿水。打開(kāi)柱子入口，連續(xù)向柱中通入三級(jí)

水（10個(gè)柱體積），保持床層穩(wěn)定。

11

5.6.3.3樣品測(cè)定

以BufferA溶液平衡，流速為2mL/min，蛋白上樣5mL。經(jīng)BufferA溶液淋洗至淋洗

液沒(méi)有蛋白出現(xiàn)，再經(jīng)BufferB洗脫，收集對(duì)應(yīng)洗脫峰。記錄洗脫峰體積V洗脫峰（mL）和

濃度C洗脫峰（mg/mL）。

5.6.4結(jié)果

根據(jù)公式（4）計(jì)算洗脫峰的蛋白含量。

………………（6）

式中：

M——洗脫峰蛋白含量（mg）；

C洗脫峰——洗脫峰蛋白濃度（mg/mL）；

V洗脫峰——洗脫峰體積（mL）。

根據(jù)公式（5）計(jì)算瓊脂糖白球非特異性吸附情況。

………………（5）

式中：

W非特異吸附——非特異性吸附量（μg/mL）；

C洗脫峰——洗脫峰的蛋白濃度（mg/mL）；

V洗脫峰——洗脫峰的體積（mL）；

5.6.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)平均值的20%。

5.7微生物污染

5.7.1儀器

5.7.2.1空培養(yǎng)皿：Φ9.00cm。

5.7.2.2錐形瓶。

5.7.2.3恒溫箱。

12

5.7.2.4微量移液器。

5.7.2.5無(wú)菌槍頭。

5.7.2.6旋渦混合器。

5.7.3測(cè)定步驟

5.7.3.1樣品前處理

在空培養(yǎng)皿底部標(biāo)記樣品名稱。按照（GBT5475-2013離子交換樹(shù)脂取樣方法）直接

從產(chǎn)品中抽取5mL樣品，置于50mL砂芯漏斗中抽干5min。取1mL抽干介質(zhì)，加入1mL

三級(jí)水，采用旋渦混合器混勻樣品。將含有30mL胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的錐形瓶進(jìn)行高

溫滅菌（121°C，20min），待培養(yǎng)基冷卻到40°C時(shí)，用微量移液器吸取1mL混勻后的樣

品加入到該錐形瓶中，緩緩混合，把混合物倒入培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋。

5.7.3.2凝固混合物

在室溫下使混合物凝固。

5.7.3.3孵育

把培養(yǎng)皿置于恒溫箱中孵育。在孵育期間培養(yǎng)皿需要倒置，在35℃中放置5天。

5.7.4結(jié)果表示

孵育期后檢查培養(yǎng)皿。計(jì)數(shù)菌落形成單位數(shù)（CFU），估計(jì)每毫升樣品中微生物的數(shù)量。

5.7.5允許差

同一試樣三次測(cè)定結(jié)果之差，應(yīng)不超過(guò)5。

5.8化學(xué)穩(wěn)定性

5.8.1試劑

5.8.1.41mM鹽酸（pH3）。

5.8.1.5三級(jí)水（pH7），GB6682-92《分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室用水的規(guī)格及試驗(yàn)方法》。

5.8.1.6100mM氫氧化鈉（pH13）。

5.8.1.7甲醇：色譜純。

5.8.1.8甲醇溶液：10%，吸取100mL的甲醇到1000mL的容量瓶中，定容。

13

5.8.1.9標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：羥甲基糠醛純度≥99%。

5.8.1.10標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量的羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100mL容量瓶，用10mL

甲醇溶解，定容，配成0.20mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此溶液可在溫度低于4℃冰箱中冷藏保存

兩個(gè)月。

5.8.1.11標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量的羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至100mL容量瓶中，用

10%甲醇溶液稀釋至刻度，配成0.01μg/mL，0.03μg/mL，0.05μg/mL，0.08μg/mL，0.10μg/mL，

0.20μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，6.0μg/mL，10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。當(dāng)天新

鮮配制。

5.8.2儀器

5.8.2.1帶蓋玻璃試管。

5.8.2.2玻璃濾瓶。

5.8.2.3砂芯漏斗（G3）。

5.8.2.4真空泵：極限真空0.10MPa。

5.8.2.5旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

5.8.2.6高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器。

5.8.2.7注射器：10mL。

5.8.2.8過(guò)濾膜：0.45μm。

5.8.3測(cè)定步驟

5.8.3.1樣品處理

方法同5.1.3.1。

5.8.3.2將樣品置于不同pH溶液中培養(yǎng)

取若干份1.00g抽干白球置于帶蓋玻璃試管內(nèi)。將上述pH3-13的溶液各10mL分別置

于各試管內(nèi)，平行實(shí)驗(yàn)三次。樣品管在40°C條件下培養(yǎng)7天。7天后，上層清液被轉(zhuǎn)移到

干凈的試管內(nèi)。

5.8.3.3上機(jī)前樣品處理

上層清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（60℃，50轉(zhuǎn)/分），定容至2mL，加入等體積12M鹽酸，100℃

水解1h。定容至5mL。另取1.00g抽干白球，加入4mL6M鹽酸，100℃水解1h。定容至

5mL。用0.45μm的濾膜過(guò)濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測(cè)器測(cè)定。

14

5.8.3.4色譜測(cè)定

1）液相色譜條件

a）色譜柱：DiamonsilC185μm，250mm×4.6mm（i.d.）或相當(dāng)者；

b）流動(dòng)相：甲醇+水（10+90）；

c）流速：1.0mL/min；

d）檢測(cè)波長(zhǎng)：285nm；

e）柱溫：30℃；

f）進(jìn)樣量：10μL。

2）液相色譜測(cè)定

首先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在上述色譜條件下的峰面積，以峰面積對(duì)相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作

曲線，然后測(cè)定未知樣品，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。樣品溶液中羥甲基糠醛的響應(yīng)

值應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，羥甲基糠醛的參考保留時(shí)間為9.79-10.40min

范圍內(nèi)，保留時(shí)間隨樣品濃度變化而變化濃度越低保留時(shí)間越小。羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜

圖和含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖參加圖。

a

b

圖3羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖（其中a為濃度0.01mg/L，b為濃度10mg/L）

15

圖4含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖

3）空白試驗(yàn)

除不加樣品試液外，均按上述步驟進(jìn)行。

5.8.4結(jié)果

上清液中的羥甲基糠醛的含量按下式計(jì)算獲得，計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。

…………（6）

式中：

X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量（mg/L）；

c——從工作曲線求得的試樣溶液中羥甲基糠醛的含量（mg/L）；

V——試樣最終的定容體積（mL）；

V0——試樣的取樣體積（mL）。

介質(zhì)在不同pH溶液中的脫落按下式計(jì)算獲得。

16

X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量（mg/L）；

X0——抽干白球試樣中羥甲基糠醛的含量（mg/L）。

5.8.5允許差

同一試樣