基因敲除技術基因敲除技術第1頁基

因

敲

除1.基因敲除介紹2.基因敲除方法及其原理3.基因敲除應用基因敲除技術第2頁基因敲除介紹漢字名稱：基因敲除或基因剔除英文名稱：geneknock-out;geneknockout定義1：將細胞基因組中某基因去除或使基因失去活性技術。去除原核生物細胞、真核生物生殖細胞、體細胞或干細胞基因組中基因等。廣義基因敲除包含某個或一些基因完全敲除、個別敲除、基因調控序列敲除以及成段基因組序列敲除。所屬學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；方法與技術（二級學科）定義2：將細胞基因組中某基因去除或使基因失去活性方法。敲除基因用以觀察生物或細胞表型改變，是研究基因功效主要伎倆。所屬學科：細胞生物學（一級學科）；細胞生物學技術（二級學科）定義3：在基因組水平上改變或破壞靶基因結構，使其功效完全喪失試驗技術。所屬學科：遺傳學（一級學科）；發育遺傳學（二級學科）基因敲除技術第3頁基因敲除介紹定義：經過一定路徑使機體特定基因失活或缺失技術。1234567123456790890基因敲除基因敲除技術第4頁基因敲除方法及其原理通常意義上基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計同源片段替換靶基因片段，從而到達基因敲除目標。伴隨基因敲除技術發展，除了同源重組外，新原理和技術也逐步被應用，比較成功有基因插入突變和RNAi，它們一樣能夠到達基因敲除目標?；蚯贸夹g第5頁基因敲除技術同源重組法插入突變法RNAi法基因敲除技術第6頁利用基因同源重組進行基因敲除利用同源重組構建基因敲除動物模型基礎步驟（以小鼠為例）7基因敲除技術第7頁a.基因載體構建

把目標基因和與細胞內靶基因特異片段同源DNA分子都重組到帶有標識基因載體上，成為重組載體。基因敲除技術第8頁b．ES細胞取得：

現在基因敲除普通采取是胚胎干細胞，最常見是鼠，而兔，豬，雞等胚胎干細胞也有使用。ｃ.同源重組：

將重組載體經過一定方式導入同源胚胎干細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中對應個別發生同源重組，將重組載體中DNA序列整合到內源基因組中，從而得以表示基因敲除技術第9頁ｄ．選擇篩選已擊中細胞：

當前常見方法是正負篩選法（PNS法），標識基因特異位點表示法以及PCR法。其中應用最多是PNS法。ｅ．表型研究：

經過觀察嵌和體小鼠生物學形狀改變進而了解目標基因改變前后對小鼠生物學形狀改變，到達研究目標基因目標?；蚯贸夹g第10頁f．得到純合體：

因為同源重組經常發生在一對染色體上中一條染色體中,所以假如要得到穩定遺傳純合體基因敲除模型，需要進行最少兩代遺傳。基因敲除技術第11頁基因敲除是80年代后半期應用DNA同源重組原剪發展起來。該方法經過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定位點，以到達定點修飾改造染色體上某一基因目標，克服了隨機整合盲目性和偶然性，是一個理想修飾、改造生物遺傳物質方法。直到現在，利用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍使用方法?；蚯贸夹g第12頁利用隨機插入突變進行基因敲除

此法利用一些能隨機插入基因序列病毒，細菌或其它基因載體，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變細胞庫，然后經過對應標識進行篩選取得對應基因敲除細胞。

基因捕捉法是最近發展起來利用隨機插入突變進行基因敲除新型方法。技術原理：基因敲除技術第13頁插入載體選擇：依據細胞不一樣，插入載體選擇也有所不一樣。1)逆轉率病毒可用于動植物細胞插入；2)植物細胞中農桿菌介導T-DNA轉化和轉座子比較常見；3）噬菌體可用于細菌基因敲除?；蚯贸夹g第14頁基因捕捉法優點

面對人類基因組計劃產生出巨大功效未知遺傳信息，傳統基因敲除方法顯得有些力不從心。所以，基因捕捉法應運而生，利用基因捕捉能夠建立一個攜帶隨機插入突變ES細胞庫，節約大量篩選染色體組文庫以及構建特異打靶載體工作及費用，更有效快速地進行小鼠染色體組功效分析。

基因捕捉法缺點

只能剔除在Es細胞中表示基因。用基因捕捉法進行基因剔除另一個缺點是無法對基因進行精細遺傳修飾?；蚯贸夹g第15頁RNAi引發基因敲除RNAi基因敲除優點及應用

①.比用同源重組法愈加簡便，周期大大縮短。

②.對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡基因，能夠在體外培養細胞中利用RNAi技術研究它功效。

③.因為RNAi能高效特異阻斷基因表示，它成為研究信號傳導通路良好工具。

④.RNAi還被用來研究在發育過程中起作用基因，如可用RNAi來阻斷一些基因表示，來研究他們是否在胚胎干細胞增殖和分化過程中其起著關鍵作用?；蚯贸夹g第16頁基因敲除技術應用①．建立生物模型

在基因功效，代謝路徑等研究中模型生物建立非常主要?；蚯贸夹g就經常見于建立某種特定基因缺失生物模型，從而進行相關研究。這些模型能夠是細胞，也能夠是完整動植物或微生物個體。最常見是小鼠。

基因敲除技術第17頁②.提供廉價異種移植器官

眾所周知，器官起源稀少往往是人體器官移植一大制約原因，而大量廉價異種生物如豬等器官卻不能用于人體。這是因為異源生物基因會產生一些能引發人體強烈免疫排斥異源分子，假如能將產生這些異源分子基因敲除，那么動物器官將能用于人體疾病治療，這將為患者帶來具大福音?；蚯贸夹g第18頁③疾病分子機理研究和疾病基因治療

經過基因敲除技術能夠確定特定基因性質以及研究它對機體影響。這不論是對了解疾病根源或者是尋找基因治療靶目標都有重大意義。對于日益威脅人體健康腫瘤而言，它產生多是抑癌基因突變結果，所以，可應用基因敲除技術制備人類癌癥鼠模型。同時，應用RNAi技術能夠特異地殺傷帶有異?；蚰[瘤細胞?；蚯贸夹g還可用于治療遺傳病，包含去除多出基因或修飾改造原有異?；蛞缘竭_治療目標。基因敲除技術第19頁

④免疫學中應用

同異源器官移植相同，異源抗體用于人體時或多或少會有一定免疫排斥，使得人用抗體類藥品生產和應用受阻。而假如將動物免疫分子基因敲除，換以人對應基因，那么