受激發(fā)射損耗(STED)熒光顯微術StimulatedEmissionDepletion受激輻射光淬滅2023最新整理收集do

something熒光物質(zhì)有機熒光物質(zhì)是一類具有特殊光學性能的化合物,它們能吸收特定頻率的光,并發(fā)射出低頻率(較長波長)的熒光來釋放所吸收的能量。某些有機化合物在紫外和短波長的可見光的激發(fā)(這種用來激發(fā)的光叫激發(fā)光)下能發(fā)出熒光,產(chǎn)生可見光譜中鮮艷的顏色,這類物質(zhì)稱為日光型熒光染、顏料。

熒光物質(zhì)分子一般都含有發(fā)射熒光的基團(稱為熒光團)以及能使吸收波長改變并伴隨熒光增強的助色團

受激發(fā)射損耗的基本原理如果你有一根粗筆，怎么能夠用它畫細線？買塊橡皮。先畫個粗的，再擦去兩邊的多余部分.STED用的就是這個原理。使用一種合適的激光,僅激發(fā)一個點的熒光基團使其發(fā)光,然后再用一個面包圈樣的光源抑制那個點周圍的熒光強度,這樣就只有一個點發(fā)光并被觀察了.

受激發(fā)射損耗的基本原理激發(fā)光可以使基態(tài)熒光粒子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),隨后用損耗光(損耗光就是用來損耗熒光的光)照射樣品,引起熒光物質(zhì)的受激輻射,消耗了可以發(fā)射熒光的能級(熒光態(tài))上的粒子數(shù)。受激輻射的作用是迫使粒子在它們被激發(fā)之后立刻回到基態(tài),使焦斑上那些受到損耗的熒光分子失去發(fā)射熒光光子的能力,而剩下的可發(fā)射熒光區(qū)被限制在小于衍射極限區(qū)域內(nèi),于是獲得了一個小于衍射極限的發(fā)光點.激發(fā)光將基態(tài)粒子激發(fā)到激發(fā)態(tài)后,向下躍遷的幾率K=σ×I.其中σ是分子的吸收截面,I是損耗光的光強.損耗光的光強越大,損耗的熒光分子越多通過損耗后,外圍的熒光被強烈地損耗而留下中心的熒光,但是邊緣仍會有殘留熒光,可以通過改變?nèi)肷涔獠ǖ牟ㄇ胺植紒砟：吘壍臒晒?熒光的產(chǎn)生是自發(fā)輻射,處于激發(fā)態(tài)被損耗光照射后是受激輻射,受激輻射發(fā)出的光子與吸收的光子相同,選擇合適的波長的損耗光就可以使激發(fā)態(tài)的染料發(fā)出特定波長的光(激光的原理).損耗光的波長要選在熒光發(fā)射譜的紅邊,以避免重激發(fā),激發(fā)光與損耗光的時間差要選的合適,既保證有熒光產(chǎn)生,又能保證一定的損耗幾率.STED熒光顯微鏡示意圖環(huán)形的損耗光是利用一個位相片進行光位相調(diào)制，最終在焦點處形成環(huán)形光分布。按順序先給激發(fā)脈沖(2ps左右)，等熒光物質(zhì)躍遷上去了,馬上給一個受激輻射波長的脈沖（250ps左右），用二向色鏡區(qū)分受激輻射跟自發(fā)輻射，探測過來的自發(fā)輻射信號,移動樣本就可以三維成像.起初的主要用于突破STEM顯微鏡主要用于突破橫向衍射極限,橫向分辨率可達70nm,而軸向分辨率還較低,因為有限的孔徑角導致軸向分辨率降低.近來將和4pi顯微術互補性地結(jié)合,在技術上擴大了有效孔徑角.目前已經(jīng)獲得了100nm的軸向分辨率.熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎術語熒光物質(zhì)：

某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線—熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)：

能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長)488nm520nm異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光(EMISSION):

發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長)熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI,Dapi)、標有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE):

組織或細胞中的某些成份受激發(fā)時可發(fā)出熒光—自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)：

熒光物質(zhì)受激發(fā)時，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失—漂白。二、熒光顯微鏡術的基本原理熒光顯微鏡激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長范圍的激發(fā)光。

帶通濾色鏡(BP)：有寬、窄帶之分。如：BP450-490

長、短通濾色鏡組合（LP+KP）：LP450+KP490

雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長，透過長波長。阻斷濾鏡：多為長通濾色鏡；LP490紫外藍綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標記結(jié)構的熒光光學圖像光學成像濾鏡分光488nm520nmFITC450nm490nm熒光顯微鏡的不足:1.無法實現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多重熒光的同時采集及共定位。2.熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對細胞組織的照射損傷。4.無法對樣品進行斷層掃描,完成3D的工作。5.濾鏡對熒光信號衰減大,靈敏度—熒光強度不夠。6.可以觀查活細胞或組織但細胞或組織內(nèi)結(jié)構高度重疊7.只能在二維環(huán)境下觀察。8.樣品不能太厚。9.熒光的串繞無法回避。10.放大倍率小。2.基本組成一、基本組成（一）激光器:多線氬離子(458nm,488nm,514nm)、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633nm)（二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器)（三）光學裝置：根據(jù)樣品中熒光信號的強弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號。（四）計算機圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時間和空間，并和同時采集樣品中多重熒光信號的分解及合成圖像，對其進行定量測定。3.共聚焦原理利用照明針孔和探測針孔實現(xiàn)點照明和探測，并且被探測點位于焦平面。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點。共聚焦原理共聚焦原理1.點照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）共聚焦原理假設是場照明（非共聚焦），會導致：一.發(fā)生衍射，使像模糊；

二.散射光干擾（即除了成像點外，其余點處有散射光進入探測針孔）；

而點照明則不會有這些問題。共聚焦原理消除衍射影響消除背景雜光共聚焦原理2.焦平面點成像共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點所成的像的光像被探測針孔擋住，不會進入光探頭，所以焦平面點成像使像更清晰。共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。4.X—Y軸掃描奧林巴斯Fluo