第第頁(yè)單寧酶（Tannase，TAN）試劑盒說(shuō)明書(shū)單寧酶（Tannase，TAN）試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法100管/48樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：?jiǎn)螌幟溉Q(chēng)是單寧酯酰水解酶（Tannase，EC3.1.1.20），它可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖。測(cè)定原理：使用抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，在270nn下測(cè)定底物PG反應(yīng)前后的光密度變動(dòng),計(jì)算單寧酶酶活力。需自備的的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽、冰、蒸餾水試劑的構(gòu)成和配制：試劑一：液體100mL×2瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×1支，4℃保管；臨用前每支加入6mL試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑4℃保管；粗酶液提取：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。液體樣本：直接取上清測(cè)定。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)到270nm，蒸餾水調(diào)零。2、加樣表試劑名稱(chēng)（μL）對(duì)照管測(cè)定管95℃水浴5min后滅活的粗酶液50粗酶液50試劑二5050混勻，40℃準(zhǔn)確保溫10min后，置95℃水浴中10min（蓋緊，防止水分散失），冷卻試劑一900900混勻，取200uL至微量石英比色皿或96孔UV板中，270nm處讀取各管吸光值。計(jì)算ΔA=A對(duì)照A測(cè)定。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)個(gè)一個(gè)對(duì)照管。注意：1.可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min95℃沸水浴處理。2.務(wù)必使用96孔UV板（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。TAN活力單位的計(jì)算a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=0.0058x+0.0044，R2=0.9994；x為PG含量（mol/L），y為吸光值。1、按樣本體積計(jì)算單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。TAN活性（mol/min/mL）=（ΔA0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T=34.48×（ΔA0.0044）2、依照蛋白濃度計(jì)算單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少0.01mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。TAN活性（（mol/min/mgprot）=（ΔA0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷（V樣×Cpr）÷T=34.48×（ΔA0.0044）÷Cpr3、依照樣本鮮重計(jì)算單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。TAN活性（mol/min/g鮮重）=（ΔA0.0044）÷0.0058÷1000×V反總÷0.01÷（V樣÷V樣總×W）÷T=34.48×（ΔA0.0044）÷WV反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為y=0.0029x+0.0044，R2=0.9994；x為PG含量（mol/L），y為吸光值。1、按樣本體積計(jì)算單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少0.01mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。TAN活性（mol/min/mL）=（ΔA0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷V樣÷T=68.97×（ΔA0.0044）2、依照蛋白濃度計(jì)算單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少1mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。TAN活性（mol/min/mgprot）=（ΔA0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷（V樣×Cpr）÷T=68.97×（ΔA0.0044）÷Cpr3、依照樣本鮮重計(jì)算單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少0.01mol底物PG所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。TAN活性（mol/min/g鮮重）=（ΔA0.0044）÷0.0029÷1000×V反總÷0.01÷（V樣÷V樣總×W）÷T=68.97×（ΔA0