犬細小病毒病診斷技術PAGEPAGE8犬細小病毒病診斷技術范圍本文件規定了犬細小病毒病的臨床檢查、血凝與血凝抑制試驗、PCR檢測、熒光定量PCR、膠體金試紙檢測的操作方法。PCR檢測、熒光定量PCR（GB/T6682 NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范本文件沒有需要界定的術語和定義。GB/T6682FK81細胞(。0.9%AA.1。1%AA.2。Taq10倍TaqTaq5U/μL，-20℃保存。1.5mLEppendorf0.2mLPCRdNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP10mmol/L，-2010%A。AA.4。AA.6。Premix。PCR儀412000gPCR140或6.2.26.3.1或6.3.3PCR(HA)除了特別規定外，本文件中涉及到的樣品采集及處理操作方法符合NY/T541獸醫診斷樣品采3000g15min在96孔“v”100501.5mLEppendorf50至第至第31150孔1:22孔1:43孔1:8……121%5015min~30100%凝集()HA在96孔“v”1050和124CPV第150μL50至第1101孔1:22孔1:43孔1:8……由第1150μL，4125037PCR7.1。CPVDNA46525μL10%10的20mg/mL蛋白酶h500μL20s，12000g5min(25:24:1)205醇205g1050DNADNAPCR引物：濃度為20μmol/L其序列如下：上游引物(CPVF)：5'GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC3'；下游引物(CPVR)：5'GTGCACTATAACCAACCTCAGC3'。在0.2mLPCR10Taq250.5酶0.5模板2(CPVF、CPVR)各0.518.5μLPCRPCRPCR94℃變性2303040進行353。用TBE1.5%(0.5μg/mLEB)AA.710μLPCRA中A.8DNA5V/cm電泳約30minPCR609bp8.4.1609bp609bp熒光定量PCR操作步驟同8.1。采用TaqMan探針法。VP1-F:5'-GACAATCTTGCACCAATGAG-3'；VP1-R:5'-CCAGATCCTGTAGCTCTTTC-3'VP1-P:5’-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ)-3’DNA操作步驟同8.2。實時熒光定量PCR檢測在0.2PR薄壁管中按每個樣品PexxaPbePCR（X10L、A模板5L、10pmol/μL）0.50.53.5μL檢測體系。將PCR管置熒光定量PCR953min，9510s，6030s，45陰性對照無Ct陽性對照的Ct35S無Ct值或Ct值>40，并且無特定擴增曲線，表明犬細小病毒核酸陰性?Ct值≤40，且出現特定的S型擴增曲線，表明犬細小病毒核酸陽性。Ct值大于35.0的樣本為弱陽性樣本，需排除樣本或產物污染的可能。如需復核，建議重提核酸復核。對于Ct40Ct值≤40—1010.1.23～4（80～120110～20min30min（C）（T）（C）（C）（T）1、910符合標準臨床癥狀符合6.2.1或6.2.2且出現6.3.1或6.3.3的病理變化，其他臨床癥狀和病理變化可作78、9、106（7、、9106（10A.10.9%生理鹽水

附錄A（資料性附錄）試劑及其配制稱取9g無水氯化鈉溶于1000mL去離子水中配成0.9%生理鹽水，121.3℃滅菌15min。1%1mL新鮮肝素抗凝豬血加入9mL滅菌生理鹽水制備而成。制備好后最好立即使用。暫時不用可放置4℃冰箱保存。CPVCPV接種FK81細胞，培養3d~5d，當病變達60%~80%時收獲，凍融三次或超聲波處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液分裝后低溫保存。10%(SDS)在90mL三蒸水中溶解10g十二烷基硫酸鈉(電泳級)，加熱至60℃助溶，用鹽酸調pH值至7.8，加三蒸水定容至100mL。貯備液(20mg/mL)每升三蒸水中加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.21mg，乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg，十二烷基硫酸鈉(SDS)5g，用鹽酸調pH值至7.8。取該溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分裝。每升三蒸水中加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2.9mg，硼酸27.5g，用5