富營養化湖泊藍藻水華的生態治理

隨著城市和工業的發展以及農業化肥的大量使用，已處理的城市生活廢水和工農業廢水直接排入湖泊和河流，導致氮、磷等養分積累，并大量繁殖低級水生生物，如蘭藻和其他水生生物，形成“水花”。水華的發生導致水體透明度下降,水質惡化,產生異味,對湖泊(水庫)的多種用水功能(飲用、水產養殖等)和觀賞功能造成嚴重損害。很多水華藻類(如水華魚腥藻)能夠固氮,導致水體的富營養化進程加速發展。國內營養化湖泊類型中,藍藻型富營養化為典型代表,如巢湖、太湖、滇池和南京的玄武湖等。這些湖泊水華暴發期間,銅綠微囊藻是滇池水華的絕對優勢種。銅綠微囊藻含有肝毒素,對人類健康存在潛在危害。近幾年來,中央和地方為治理富營養化湖泊藍藻水華投入了大量資金,滇池耗資40億,太湖耗資100個億,一些小型城市湖泊的治理也是動輒上億元。采用了控制污染源、底泥疏浚、氧化溝技術、直接打撈藻華、生化綜合除藻法,以及利用大型水生植物吸收營養鹽來控制富營養化等多種方法,這些措施在一定程度上緩解了營養鹽的人為增加引起的富營養化,但對水華的控制都沒有取得令人滿意的效果。藍藻水華是一個典型的生態問題,生態問題只能用生態學方法去解決。控制和治理藻華的關鍵是找到一種能夠直接有效殺死或者抑制藻類生長的因子,經濟而便于大規模使用,而且不會造成二次污染。使用化學殺藻劑雖然可以在一段時期內有效的控制水華,但是價格昂貴,而且可能產生二次污染。即使化學殺藻劑不快速產生負面影響,也會增加湖泊底泥中有害物質的濃度。而生物控藻因子(主要是微生物制劑)則不會產生類似問題,是一種很有前景的控藻因子。1控藻因子的應用自然界中有很多生物都可以抑制藻類的生長,它們主要包括:藍藻病毒(噬藻體)、溶藻細菌、原生動物、真菌和放線菌。它們直接分離于自然界,因此使用這些生物控藻,不會像營養源控制(下行調控)和“生物操縱”(Biomanipulation)那樣對湖泊生態系統產生根本的改變。它們適合在水華發生初期使用,短期內控制藻類生物量或者阻止藻類大量增殖。原生動物是水生食物鏈中的重要環節,很多原生動物可以取食藻類,有些甚至以藻類為惟一食物。在湖泊和海洋水生態系統中,藻類生物量的下降往往伴隨著原生動物數量的急劇增加。比較各種控藻生物因子的環境適應力、繁殖能力、控藻效力、宿主范圍、對宿主改變的適應能力以及不利環境下的抗逆性等多種因素,人們認為原生動物是一種很有實用前景的控藻因子。原生動物作為控藻因子有以下優勢:(1)原生動物取食范圍廣。已經分離到取食微囊藻、魚腥藻、束絲藻等滇池優勢藻種的原生動物。(2)原生動物食量大,實驗室中觀測到,只要原生動物數目達到某一閥值,體系中的藻細胞會被迅速消耗殆盡。(3)很多原生動物在食物耗盡時會形成包囊,度過食物缺乏期。當藻類重新增多時,包囊又會破壁復蘇成為食藻營養體。(4)包囊結構具有很強的抗逆性,這種形式容易包裝和運輸。(5)容易繁殖。原生動物可以利用有機培養基大量發酵培養。2海藻原生動物的科學研究食藻原生動物主要分為:鞭毛蟲、變形蟲和纖毛蟲三個大類,下面將對三大類的主要食藻種類以及研究情況作簡單的介紹。2.1微生物細胞的生長目前報道的食藻鞭毛蟲主要屬于金滴蟲目(Chrysomonadida),特別是其中的棕鞭毛蟲(Ochromonas)。1973年,Daley等人在開放體系中培養藍藻時,發現了一種引起組囊藻(Anacystisnidulans)死亡的污染物,將少量的污染物接種到純培養的組囊藻藻液中,會在6—24h內將藻細胞生物量降至極低水平,同時體系中Ochromonas大量繁殖。進一步研究發現,組囊藻藻細胞的消失是由于Ochromonas的吞食作用,并不是由于相關的細菌或者鞭毛蟲釋放的溶藻性物質。通過透射電鏡,還在Ochromonas的食物泡中發現了處于不同消化時期的組囊藻細胞。同時Prows和McIlhenny還報道了四種可以取食銅綠微囊藻的Ochromonas,分別是:Och.Bastrop、Och.ovalis、Och.malhammensisi和Och.danica。他們用電子顯微鏡和細胞化學等方法研究Ochromonas對藍藻細胞的吞食和消化,他們發現當Ochromonas吃進足夠多的微囊藻細胞之后,身體由葉片狀變成圓球狀。2.2吸食藻類種類對湖泊水華的影響早在1897年,Leidy就報道了Amoebaradiosa,A.verrucosa和A.proteus等變形蟲取食“藍綠藻”(Blue-greenalgae),當時的藻類及原生動物命名系統還不完善,所謂的“藍綠藻”相當于今天的藍藻(Cyanobacteria)。Ho和Alexander于1974年也發現Amoebaradiosa和Amoebadiscoides可以取食組囊藻(Ancystisnidulans)以及三種魚腥藻,并發現這些變形蟲體內有類似于溶菌酶的物質可以降解吞入體內的藻細胞。其他已報道的取食藍藻的葉足綱(Lobosea)原生動物還有:Thecamoebasphaeronucleolus,Pelomyxapalustris。本實驗室從滇池水樣中分離到了一種納氏蟲(Naegleria),取食魚腥藻,席藻(Phormidium),柱孢藻(Cylindrospermum),隱球藻(Aphanocapsa)等多種藻類,控藻效果顯著(圖1)。自然界中,有一類絲足類(Fliosea)變形蟲,它們與藻類關系密切,往往和藻類共生或寄生與藻類上,以藻類為主要食物。絲足類變形蟲身體呈圓球狀,放射性的發出絲狀偽足(Filopod),并以此移動和取食。其中報道最多的食藻種類是核蟲類(Nuclearia)和吮噬類(Vampyrella)。1981年,Yamamoto從日本的Kasumingaura湖中分離到了一種核蟲,這種核蟲可以在銅綠微囊藻(Microystisaeruginosa)、組囊藻(Anacystisnidulans)和桶狀魚腥藻(Anabaenacylindrica)的藻苔上形成食藻斑。這種核蟲通過刺透真核藻角星鼓藻(Staurastrum)和新月芽藻(Closterium)的細胞壁取食其細胞內容物,但是它取食原核藻微囊藻或者魚腥藻時,直接吞食整個藻細胞。通過分析藻苔上形成的各種溶藻斑,Yamamoto發現原生動物形成溶藻斑的頻率遠遠大于其他溶藻因子(細菌和真菌),并據此推斷原生動物可能是湖泊水華的主要控制因素。Huang和Wu于1982年利用藻苔食斑形成法從稻田里分離到了一種肉足類變形蟲和一種核蟲,這兩種變形蟲都可以以魚腥藻作為惟一食物,并且還可以取食念珠藻(Nostoc),顫藻(Oscillatoria)和單歧藻(Tolypothrix)等其他藻類。其中核蟲可以取食各個種類的魚腥藻,但是魚腥藻附生子和異型胞不被取食。這兩種變形蟲都可以顯著降低藻液中魚腥藻細胞生物量,當食物耗盡時,它們會形成包囊。對核蟲的進一步研究還有Yamamoto、Daft和Cann等人的報道。本實驗室從滇池水樣中分離得到了4種不同的核蟲。可見核蟲在滇池水環境中普遍存在,很可能對滇池水華有一定的控制作用。2.3藍藻和紅藻藻類的食性纖毛門(Ciliophora)包括三個綱:動基片綱(Kinetofragminophora)、寡膜綱(Oligohymenophora)和多膜綱(Polymenophorea),現已發現每個綱都有多種食藻纖毛蟲,尤其動基片綱的食藻纖毛蟲種類很多。據目前為止的報道,該綱中有18個屬30多個種具有食藻能力,如:Holophrya、Merodinium(分裂蟲)、Trachelius、Sonderia、Bryophrya、Colpoda(腎形蟲)、Woodruffia、Furgasonia和Nassula(籃環蟲)等。其中對籃環蟲研究得最為深入。早在1941年,Thomas最先認識到了籃環蟲在富藻類湖泊中重要的生態作用,他觀察到一個瑞士湖泊中顫藻(Oscillatoriarubescencs)水華的消退是由于大量金色籃環蟲(Nassulaaurea)的牧食作用(Grazing)。1959年,Poilvert對籃環蟲的食性范圍作了詳細研究,20種實驗藻種中的9種(其中包括顫藻、束絲藻、魚腥藻和席藻)可以支持金色籃環蟲的大量增殖,其他種類只能維持其有限的繁殖。1983年,Brabrand等人嘗試了用籃環蟲作為一種生物控藻劑,并根據籃環蟲與顫藻的取食/被取食關系做了一系列的實驗室和野外實驗。1990年,Hildam等人對英國坎布里亞郡(Cumbria)三個湖泊中籃環蟲的取食作了詳細的觀察。通過長時間對湖泊中藻類及原生動物種類與數量上的觀察,他們發現湖泊中的主要水華藻類(水華束絲藻和顫藻)的大量繁殖和突然消退,和籃環蟲數量及生活形態(營養體/包囊)密切相關。隨著水華的消退,籃環蟲會形成包囊并沉到湖底,當水華發生時,包囊會萌發(Excystment)成為營養體,并回到湖面上層開始繁殖和牧食。1983年Takamura和Yasuno報道在日本的Kasumigaura湖中發現一種Condylostomavorticella取食藍藻和真核藻類。它們主要根據藻細胞的形態和大小選擇取食的藻類,它們偏好球狀的微囊藻(Mirocycystis)、聚球藻(Synechococcus)和束球藻(Gomphosphaeria),而不取食鏈狀的席藻(Phormidium)和束絲藻(Aphanizomenon)。本綱主要的食藻種類是前口蟲(Frontonia)、尾絲蟲(Uronema)和睫桿蟲(Ophryoglena)。Schaeffer發現顫藻(Oscillatoria)和鞘絲藻(Lyngbya)構成一種前口蟲(Frontonialeucas)食物的重要成分。這種纖毛蟲可以取食比自己身體長6到8倍的顫藻藻絲,被取食的藻絲卷曲在纖毛蟲體內。一種海洋尾絲蟲在海洋中分離出的集胞藻(Synechococcus)培養物(還有伴生的細菌)中生活一年以上。在尾絲蟲(Uronema)對數生長期期間,它選擇性的主要取食集胞藻,藍藻數量下降了三個數量級,而細菌的數量只下降了一個數量級。3生物控藻因子分析原生動物的研究方法包括:分離、純化、培養、鑒定,實驗室中食藻特性研究,小規模野外實驗(Microcosm)和大規模野外實驗,最終建立與之相應的生物控藻策略。以上也是對其他生物控藻因子研究所需的流程(圖2)。下面將對上述步驟作簡單介紹:3.1原生動物的純化在噬藻體、溶藻菌、真菌和原生動物等一系列控藻因子中,原生動物的體積和運動能力最強。因此用于分離食藻原生動物的水樣不應經過微孔過濾(孔徑1μm的濾膜可以阻止絕大部分原生動物通過),或者離心處理(3000r/min,1min的低速離心就可以沉降大部分的原生動物),水樣中的雜質可以用紗布過濾除去。在分離控藻因子之前,可以利用目標藻類(如魚腥藻)的藻液富集環境水樣中的控藻因子,增大控藻因子的濃度,然后利用藻苔分離。原生動物在藻苔平板上產生的食藻斑一般比噬藻體產生的噬藻斑或溶藻菌產生的溶藻斑大,而且擴大速度最快(圖1)。原生動物的純化可以利用原生動物在藻苔平板上移動速度快的特點進行。將原生動物培養物滴在藻苔平板上,培養一段時間會出現食藻斑,待食藻斑擴大出接種區,用牙簽挑取食藻斑邊緣物質接種到新的藻苔平板上。這樣可以去除和原生動物伴生的一些細菌和霉菌。一般來說,變形蟲在藻苔平板上移動速度最快,因此這種方法最適合變形蟲的分離。如果需要純化一種移動較慢的原生動物(比如纖毛蟲),其中還污染了移動較快的變形蟲,只能在顯微鏡下挑出原生動物的營養體或者包囊,轉接到新的藻板上,經過多次挑選能得到單克隆的細胞株。3.2分子進化的影響以往原生動物的微觀形態結構和生活特性是其鑒定的主要標準,但是對于一種新分離得到的原生動物來說,要通過形態結構確定其所屬的種類需要豐富的經驗和較長的時間。生物細胞中編碼rRNA的保守基因,已成為確定物種分類地位的重要標識和研究分子進化的重要參數。由于分子克隆技術的日益成熟,利用原生動物的rDNA序列鑒定其分類地位已經非常簡便快捷,主要包括以下步驟:(1)總DNA的提取。操作方法和細菌總DNA提取基本一致。(2)PCR擴增編碼rRNA基因中的保守區域。編碼rRNA的基因中存在一些和藍藻及細菌類似的極端保守區域,設計引物時應注意回避這些保守區域。(3)克隆測序。因為編碼rRNA的基因在基因組中有多個拷貝,直接對PCR產物測序往往效果不佳。(4)序列分析。利用基因數據庫(如NCBIGenBank)提供的BLAST分析,可以找到與已知rDNA相似性最高的基因序列,對應物種的系統分類可以為待定原生動物分類地位提供線索。原生動物分類地位的最終確定還需要結合形態特征,生活史等鑒定標準。3.3微鏡觀察食藻原生動物原生動物的分離鑒定、形態觀察、食藻過程研究都需顯微鏡觀察和分析。而利用熒光顯微鏡可以很方便的觀察食藻原生動物的取食及消化過程。藍藻細胞內含有大量藻膽素,在紫外光激發下可以發射出紅色熒光,藻細胞被吞食進入食物泡后,仍可以發出熒光。根據食物泡的大小和熒光強弱可以研究藻細胞物質在原生動物體內的消化情況。(圖3)3.4cold-chase法原生動物的食藻特性主要包括兩個方面:食藻范圍和食藻活性(包括以不同藻類為食物時的取食速率、消化速率以及繁殖速率)。和其他生物控藻因子不同,原生動物的食藻范圍很廣泛,往往只要形態條件符合的藻類就可以被它們取食,很多研究中利用惰性熒光顆粒(Inertlatexfluorescentmicrospheres)作為藻細胞的類似物,也可以被一些纖毛蟲吞食。Layboun發現一種馬氏蟲(Mayorella),不能直接取食眉藻(Calothrix),但是,當眉藻藻絲被超聲波打成小段碎片之后,就可以被馬氏蟲取食,并在食物泡中消化。但是某種原生動物可以取食某種藻類,并不意味著該原生動物可以作為這種藻類的控制因子,只有當藻類可以被消化,并且為原生動物的大量繁殖提供物質和能量時,這種原生動物才能顯著降低目標藻類的生物量。研究原生動物取食活性的方法可以分成三大類:(1)群體操作法,如顆粒大小分級,稀釋,或者估計食物類似物消失的速率;(2)使用示蹤技術直接測定取食速率,如,熒光標記物;(3)從自然種群的一些特征,比如原生動物消化性酶類或者它們的食物泡內容物推斷種群的取食特性。為了消除原生動物消化同時還在取食的影響,研究原生動物消化速率(Digestionrate)需要采用cold-chase的方法。在原生動物取食進入平臺期(體系中原生動物數量接近飽和,并且還有足夠的食物)后,將體系稀釋100倍,使得體系中的藻細胞數量降到一個忽略的地步,認為原生動物此時已經無法取食,同時開始記錄原生動物體內食物的消化情況。從cold-chase開始時刻以及之后4h內一些時間點取樣,固定(一般采用CaCO3飽和的福爾馬林溶液,終濃度2%),制片,并在熒光顯微鏡下利用藍藻細胞中藻膽素的紅色自發熒光估計原生動物體內未被消化的食物量。對于單細胞藻類(比如微囊藻、集胞藻)可以直接數出每個原生動物體內的藻細胞數目。而對于鏈狀藻類(比如魚腥藻、席藻)被取食后進入食物泡,失去細胞形態,只有結合顯微鏡放大倍數測量每個食物泡的直徑,算出每個原生動物中食物泡的總體積(可以認為原生動物固定后,其中食物泡成球形)。為獲得具有統計學意義的數據,每個時間點至少需要觀察100個以上原生動物,因此,需要將觀測結果拍成照片(圖3),便于分析統計。用于表征消化速率的指標有細胞內容物半衰期T1/2和消化常數K,即單位時間內,被消化食物和初始時刻食物量的百分比。4控藻因子的控制在研究自然水體原生動物的食藻過程中,有很多關于原生動物大量繁殖導致水華消退的報道。但人為主動利用原生動物控制藍藻水華奪得成功的報道不多,大都處于嘗試階段。本實驗室對分離獲得的各種食藻原生動物進行了一系列控藻實驗,結果發現,食藻原生動物在實驗室條件下對微囊藻、魚腥藻、束絲藻控藻效果非常好,但是對天然水華(采自云南滇池)的控制作用則不明顯。作者認為以下因素限制了食藻原生動物在天然水華中的控藻作用:(1)天然水體環境和實驗室培養條件之間的差異。天然水體的化學成分、溫度、pH值都可能影響到原生動物的食藻能力。(2)原生動物數量的限制。當原生動物的數量相對藻類生物量達到一定優勢時,其控藻效果才會顯現。天然水體中,原生動物增殖能力受到影響,而初次投加的原生動物會被龐大的水體稀釋到遠遠達不到控藻的濃度。(3)天然水華的復雜性。天然水華中藻的種類很多,往往主要優勢藻類(如微囊藻)數量的降低,反而引起次要藻類(如束絲藻或顫藻等)的繁盛,成為優勢種,總體藻類生物量并未明顯降低。(4)天然水華的頑固性。滇池野生銅綠微囊藻細胞外有一層黏液層,可以減小外界環境對微囊藻細胞的影響,會對食藻原生動物的取食產生極大