復方莪術油抗菌作用的初步研究目錄摘要 Ⅰ-Ⅱ1前言 前言莪術為姜科植物蓬莪術（CurcumaphaeocaulisVal.）、廣西莪術(CurcumakwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang)或溫莪術(CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling)的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經，具有行氣破血，消積止痛的功效[1]。近幾年的研究表明，莪術的主要成分為莪術油、姜黃素及多糖類成分[2]。隨著對莪術油研究的不斷發展,發現其中的主要成分為莪術烯、新莪術二酮、異莪術醇、原莪術醇、去氧莪術酮、呋喃二莪術酮、蒎烯、樟烯、樟腦、異龍腦、龍腦、桉油精、吉馬酮、異呋吉馬酮等。其中莪術油中的莪術醇和莪術二酮為抗癌有效成分，在《中國藥典》2005版一部把吉馬酮作為莪術油定量的指標性成分。莪術二酮和吉馬酮是莪術油中含量較高的主要有效成分，其具有良好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓和鎮痛抗炎的作用，常作為莪術藥材及莪術油質量控制的指標性成分。另外,莪術油中還含有對甲氧基桂皮酸乙酯,該成分具有抗菌作用。因此莪術油不僅具有治療肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥的功效，還具有消炎抗炎、止痛、抗血栓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗氧化延緩衰老等功效[3-4]。有關文獻表明[5]，蓬莪術、廣西莪術、溫莪術三個品種的揮發油含量及化學成分大致相同，但不同產地的莪術，成分也有一定的差異，在李瑤[6]的研究中表明，蓬莪術中所提取的揮發油中不含有莪術二酮，溫莪術中莪術二酮的含量卻最高，而廣西莪術揮發油中β-欖香烯的含量相對較高，研究表明廣西莪術所含的揮發油均高于其他兩者，而本實驗選用廣西莪術作為提取莪術油的藥材。復方精油利用中草藥提取物作為日用品的原料，具有藥效穩定，藥力持久，對皮膚作用溫和、刺激性小、安全性高、療效顯著等特點，符合人們生活所需且順應性好。某些復方精油還能殺死空氣中的細菌，防止瘟疫擴散[7]。有研究表明以中藥植物精油為原料研發成為空氣消毒劑，可以應用于醫院、爐管、飯店、家庭居室以及人群密集的公共場所消毒，其效果與家庭紫外消毒法、過氧乙酸熏蒸法相當[8]。中草藥揮發油目前廣泛應用于醫藥行業，比如用于跌打損傷的白花油、紅花油，用于治療痤瘡的茶樹精油等。近年來學術界對莪術油的研究較多，試圖多方面地開發莪術油的新劑型以最大化地發揮莪術油的藥用價值，但莪術油本身是混合物，其制劑的穩定性、載藥量及其毒性到目前為止都未能完全研究清楚，有待作進一步探究和完善。有研究表明大劑量莪術煎液能在短時間內使實驗大鼠的體重降低，造成肝損傷加重[9]；倘若每天給予足夠量大的莪術高蛋白粉末，在一周內大鼠死亡率達100%。為了安全有效地發揮藥物的藥用價值，減少未知副作用的影響，可以把莪術油與其他稀釋劑混合制備成其他劑型或和其他精油復方配伍使用，一方面可以減少單方精油因濃度過高而對皮膚產生刺激性、減少毒副作用，另一方面通過揮發油與稀釋劑、輔助劑等相互混合使制劑相輔相成、相互作用、增強療效、增加適用性。為此，本次實驗把莪術油與其他固定比例的多種精油按一定的配比復方使用，探究復方莪術油的抗菌作用。目前市場上的復方莪術油品種稀少且以進口藥品居多，如：星加坡金波士萬應莪術油、茂隆萬應莪術油、茂隆莪術油、印尼蜂標莪術油等，價格昂貴，貨源難求，難以滿足國內龐大的市場需求，本實驗在分析市面上常見的幾類復方莪術油處方及組方藥材的藥理研究文獻后，確定了以莪術、藿香、茶樹、迷迭香、尤加利、歐薄荷、天竺葵、檸檬草8種藥材的揮發油與基礎油橄欖油按一定的比例和組合方式進行混合，配置成若干個不同莪術比例的復方莪術油樣品，對其進行質量分析、穩定性評價和藥效評價，考察不同組方對細菌活性的影響及消腫、止癢等療效，以研發療效好，副作用少，質量標準明確的復方莪術油應用于日常生活中。本實驗研究的復方莪術油是一種能夠殺菌止癢、消炎消腫、活血祛瘀、抗炎鎮痛、驅風化濕的外用制劑，可用于筋骨扭傷、跌打損傷、蚊蟲咬傷、感冒頭痛等癥狀，具有用途廣泛，藥效顯著，對皮膚作用溫和、刺激性小、安全性高等特點，作為一種家居必備生活用品仍有很大的發展空間。2材料與儀器2.1材料表2-1實驗材料明細表材料規格生產廠家廣西莪術-廣西玉林市中藥材專業市場橄欖油250mL唯你油脂商鋪藿香油10mL阿芙精油官方旗艦店茶樹油10mL阿芙精油官方旗艦店迷迭香精油10mL重慶高島化妝品商行精油尤加利精油10mL阿芙精油官方旗艦店檸檬草精油10mL重慶高島化妝品商行精油歐薄荷精油10mL重慶高島化妝品商行精油天竺葵精油10mL重慶高島化妝品商行精油金黃色葡萄球菌-廣東藥科大學微生物實驗室大腸埃希氏菌-廣東藥科大學微生物實驗室曲霉菌-廣東藥科大學微生物實驗室營養瓊脂原料-杭州微生物試劑有限公司營養肉湯原料-杭州微生物試劑有限公司2.2試驗儀器與設備表2-2實驗儀器與設備儀器型號生產廠家紫外分光光度計UV754N上海佑科儀器儀表有限公司搖擺式高速萬能粉碎機DFY-300C溫嶺市林大機械有限公司水浴恒溫振蕩器SHA-BA金壇市宏華儀器廠立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FAS上海申安醫療器械廠數顯電熱培養箱HPX-9162MBE上海博迅實業有限公司電子天平YP502N上海精密科學儀器有限公司3實驗方法3.1莪術鑒別與檢查3.1.1性狀鑒別在挑選購買廣西莪術時，觀察廣西莪術的性狀特征、聞氣、嘗味并對其進行一定的描述。3.1.2定性鑒別熒光鑒別法是根據中藥的某些成分在紫外光燈下能產生特定的熒光鑒別來鑒別中藥的一種方法。對于鑒別人員、鑒別環境及設備均無特殊要求，操作方法簡便易行。將莪術橫切面置于紫外光燈（365nm）下觀察其熒光顏色[10]；分別將5g莪術粉末置于水中、2mol/LNaOH、2mol/LHCL溶液中浸泡適當時間，蘸取適量的莪術水浸液、2mol/LNaOH浸液、2mol/LHCL浸液于濾紙上，在紫外光燈（254nm和365nm）下觀察其熒光顏色。3.1.3吸光度檢查依據《中國藥典》2015年版中對莪術的檢查：取本品中粉30mg，精密測定，置具塞錐形瓶中，加氯仿10mL，浸泡24h，濾過，濾液移置10mL的量瓶中，補加氯仿至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法測定在242nm波長處的吸光度值，記錄數據。3.2莪術油的制備及優化3.2.1粒徑的優化本實驗把適量的莪術用搖擺式高速萬能粉碎機研磨成粗粉，過10、20、30、40目篩，取70g粉置于1000mL圓底燒瓶中，加入3~4粒沸石，加入8倍水量，按照《中國藥典》揮發油測定法甲法項下測定，（如圖3-1裝置所示）調節電熱套到最高溫度至沸騰狀態后降低溫度，保持微沸狀態蒸餾足夠時間至揮發油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發油量，同時計算提取率。將提取的莪術油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。莪術油提取率見公式(3-1)：QUOTEY=vm×100%(公式3-1)式中Y為揮發油提取率；v為揮發油體積，mL；m為樣品質量，g。圖3-1水蒸氣蒸餾提取裝置3.2.2料液比的優化將莪術粉碎過30目篩，取50g粉置于1000mL的圓底燒瓶中，分別加6、8、10、12倍水量，如上操作，調節溫度保持微沸狀態蒸餾足夠時間至揮發油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發油量，同時計算提取率。將提取的莪術油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。3.2.3加熱溫度的優化本實驗主要采用水蒸氣蒸餾法提取莪術油，但由于水蒸氣蒸餾法受熱溫度較高，物料與水接觸時間較長，有可能使揮發油的某些成分發生化學分解，如莪術二酮會不可逆地分解為莪術內脂，降低揮發油的質量，導致提取率較低，對其藥理作用產生一定的影響，故控制好電熱套的加熱溫度對莪術揮發油的提取至關重要。將莪術粉碎過30目篩，取70g粉置于1000mL的圓底燒瓶中，加入8倍水量，分別維持電熱套的加熱溫度為100℃、110℃、120℃、130℃如上操作，保持微沸狀態蒸餾足夠時間至揮發油量不再增加，放置0.5h后讀取揮發油量，同時計算提取率，并觀察揮發油的顏色。將提取的莪術油收集于棕色小瓶中，加入適量無水硫酸鈉除去殘余水分，備用。3.3復方精油抗菌實驗方法3.3.1復方精油的組方成分參考市場上幾種復方莪術油的配比及經文獻調研初步固定部分精油的配比為藿香油（2%）茶樹油（2%）歐薄荷油（2%）迷迭香油（1%）尤加利油（1%）天竺葵油（1%）檸檬草油（1%），在配置過程中，僅改變莪術油和橄欖油的含量，橄欖油作為基礎油視為無關變量，隨莪術油含量的改變而改變，最終使所有精油含量和為100%。當復方精油復合后，應用強力攪拌機攪拌以混合均勻，備用。表3-1所用植物精油基本情況種Species科Family屬Cenus主要有效成分主要作用莪術姜科姜黃屬莪術油、姜黃素及多糖類成分抗菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤、益智和延緩衰老Curcumazedoaria(Christm.)RoscgingiberifamiliaTurmeric廣藿香唇形科-黃酮類成分、廣藿香醇、廣藿香酮抗炎鎮痛解熱、抗病原微生物，保護胃腸運動[11-12]PogostemoncablinLabiatae-橄欖橄欖科橄欖屬單不飽和脂肪酸對皮膚無刺激性，有利于傷口愈合創面恢復，防止皮膚粗糙[13]Canariumalbum(Lour.)RaeuschRamusoliueuirentisCanariumindicum茶樹桃金娘科白千層屬揮發油、三萜、鞣質、脂肪酸等抗菌、抗炎、除螨、

鎮咳、抗氧化、抗腫瘤[14]Camelliasinensis(L.)O.Ktze.MyrtaceaeMelaleuca迷迭香唇形科-萜烯類、二萜酚類酚酸類和黃酮類抗氧化、抗病毒、抗菌抗炎、抗血栓[15]RosmarinusofficinalisLabiatae-尤加利桃金娘科-桉油醇、芳香烯、樟腦、茴香萜、柚油萜促進新組織構建、降低體溫、抗病毒、改善偏頭痛[16]EucalyptusMyrtaceae-檸檬草禾本科香茅屬檸檬醛、香葉醛、橙花醛、香葉醇抗炎、止痛、殺菌、防蟲以及調節消化系統、循環系統和中樞神經系統的作用[17]Cymbopogoncitratus(DC.)Stapf.

ApiaceaeLemongrassgenus歐薄荷唇形科薄荷屬胡薄荷醇、薄荷腦和薄荷酮鎮痛、止癢作用、抗病毒、殺菌、利膽、止咳作用[18]PeppermintLabiataeMenthaspicata天竺葵牻牛兒苗科天竺葵屬香茅醇,a一旅烯,芳樟醇抗菌、驅蚊、對螨蟲有驅避作用[19]PelargoniumhortorumGeraniaceaePelargoniumappendiculatum3.3.2抗菌實驗準備儀器準備將培養皿、試管、移液管、槍頭、濾紙片（5mm）、玻璃棒、接種環、涂布棒、鑷子等用牛皮紙包裹后放置于立式壓力蒸汽滅菌器中進行濕熱高壓滅菌（121℃，30min）后備用。培養基準備在本實驗中應用的主要培養基為：營養瓊脂培養基和營養肉湯培養基。營養瓊脂培養基用于血瓊脂基礎和傳代；營養肉湯培養基用于一般細菌培養、轉種、復壯、增菌等。具體成分和配制方法見表3-2。表3-2培養基的分類和配制方法名稱成分使用方法營養瓊脂培養基蛋白胨10.0g；牛肉3.0g；粉：5.0g；氯化鈉5.0g；瓊脂15.0g；PH值7.3±0.1稱取本品3.3克，加熱攪拌溶解于100mL蒸餾水中，用牛皮紙封口，121℃高壓滅菌15min，待溫度降至70℃以下裝置高溫滅菌的培養皿和試管中，經冷卻后作為固體培養基和斜面培養基用。營養肉湯培養基蛋白胨10.0g；牛肉浸粉3.0g；氯化鈉5.0g；pH值7.2±0.2稱取本品18.0g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中,分別裝于三角瓶或試管,用牛皮紙封口，121℃高壓滅菌15min后裝置高溫滅菌的試管中密封待用。注：配置好的培養基應用兩層牛皮紙封口包好，以避免雜菌的污染。菌懸液準備金黃色葡萄球菌：為革蘭氏陽性細菌，金黃色，球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。是兒童中最常見的致病菌，是毛囊炎、燙傷樣皮膚綜合癥、蜂窩組織炎及外科創傷感染的病因[20]。大腸埃希氏菌：為革蘭氏陰性菌，短桿狀且為兼性厭氧菌，直徑1μm左右，周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌常會引起腹瀉、痢疾、頭痛，發燒、惡心、嘔吐等癥狀[21-22]。曲霉菌：常見的為黃曲霉菌，其菌落生長較快，結構疏松，不同的曲霉菌有不同的形狀和顏色，大多為表面灰綠色，背面無色或略呈褐色，曲霉菌常導致角膜炎和眼內炎，偶見引起鞏膜炎、結膜炎及淚囊炎[23-24]。本實驗所用到的細菌或真菌的菌種，已經采用平板分區劃線法分離培養保存于微生物實驗室中。制作菌懸液時，首先配置好營養肉湯培養基，121℃高壓蒸汽滅菌30min，其余玻璃器皿等121℃干熱滅菌30min。滅菌完畢，取出營養肉湯，待稍冷后，于超凈工作臺中，點燃酒精燈，用已經高溫滅菌的接種環于酒精燈上灼燒2~3s，待冷卻后，在相應細菌的培養基中挑取2~3個單個菌落放入營養肉湯中，稍振搖，瓶口在酒精燈外焰處旋轉一圈，密塞，于恒溫水浴振蕩器中37℃振蕩培養24h，即得大腸桿菌菌懸液，金黃色葡萄球菌菌懸液，曲霉菌懸液。放入冰箱中于4℃保存備用。3.3.3抑菌圈實驗涂布棒、玻璃培養皿、槍頭、燒杯、試管等用牛皮紙包好，高溫滅菌。滅菌完畢后，于超凈工作臺中，點燃酒精燈（注：接種環必須經過酒精燈高溫灼燒待冷卻后方可接觸菌液，避免溫度過高使供試菌失活）。配置少量營養肉湯供稀釋菌液使用，用微量移液槍吸取定量菌懸液于試管中，再加入營養肉湯將菌液稀釋10倍，搖勻，吸取100μL稀釋液置于營養瓊脂培養基中央，并用涂布棒均勻涂布于培養基四周以確保細菌能均勻生長；然后用鑷子夾取5mm的圓形濾紙片平整地貼放于培養基中，一個培養基中貼放4~5片濾紙片；再用移液槍移取若干已配置好的不同比例的復方莪術油樣品或各種單方精油5μL滴加在濾紙片上，待精油被濾紙充分吸收后，將培養基倒平板移至37℃的恒溫箱中培養24h后觀察實驗結果，并用游標卡尺測量抑菌圈的大小。抑菌圈大小與抑菌活性、敏感程度的關系如表3-3。每種單方精油以及每份不同比例的復方莪主油重復試驗3次，記錄數據。表3-3抑菌圈大小與抑菌活性敏感程度的關系抑菌圈直徑(mm)抑菌活性敏感程度≤7.0-無菌作用7.0~9.0+低度敏感10.0~15.0++中度敏感≥15.0+++高度敏感3.4復方莪術油的質量評價3.4.1外觀性狀取3個批次起最佳抑菌作用的復方莪術油5mL于透明的膠管中，觀察并記錄其外觀性狀、黏度等方面，并對其進行描述。3.4.2離心實驗取適量復合精油微乳液，分別置于離心管中，3000r/min下離心15min后取出，觀察復合精油是否出現分層或渾濁現象。3.4.3體驗反饋將復方配置好的莪術精油裝于5mL的透明膠管中，邀請20個易被蚊蟲叮咬的同學協助，分兩組，每組10人，A組為用藥組即被咬后涂抹復方莪術油，B組為空白對照組即被咬后涂抹蒸餾水，并請求他們配合在使用前用工具尺測出被蚊蟲叮咬腫了的部分的直徑大小以及使用復方莪術油1min、2min、3min后的直徑大小，記錄數據。4實驗結果4.1莪術鑒別和檢查結果4.1.1莪術的性狀鑒別經觀察本實驗使用的莪術呈類圓形或卵形的厚片。外表皮灰黃色至灰棕色，有時可見環節或須根痕。切面黃綠色，偶有黃棕色，內皮層環紋明顯，散在“筋脈”小點，對光觀察晶瑩剔透，有光澤，氣微香，味微苦而辛。因此判斷本實驗使用的莪術為廣西莪術。且經我校中藥學院王長福教授鑒定為廣西莪術。4.1.2莪術的定性鑒別結果莪術橫切面在紫外光燈下觀察顯淡紫色熒光；在紫外光燈下，莪術水浸液顯藍紫色熒光，2mol/LNaOH浸出液顯淺黃色熒光，2mol/LHCL浸出顯深褐色熒光。4.1.3莪術紫外檢查結果表4-1廣西莪術的吸光度檢查結果廣西莪術吸光度A11.05220.94830.93540.97250.998由測定結果可知，廣西莪術的吸光度均不低于0.45，符合《中國藥典》對莪術吸光度的規定，判斷廣西莪術為合格品。4.2莪術油的制備及優化結果4.2.1粒徑的優化結果表4-2粉碎度對提取率的影響水平（目）得油量（mL）提取率（%）100.761.09201.011.44301.281.83401.251.78實驗結果如表4-2所示。實驗表明粉碎10目提取率為1.09%，20目提取率為1.44%，30目提取率為1.83%，40目提取率為1.78%，在實驗過程發現藥材適當的粉碎有利于提到揮發油的提取率，但若粉碎得過細，底部越容易燒焦，且會產生較多的泡沫影響揮發油的質量。故在優化過程中莪術粉碎過篩應選擇30目篩。4.2.2料液比的優化結果表4-3投料比對提取率的影響料液比得油量（mL）提取率（%）1:60.450.901:80.891.781:100.881.761:120.871.74注：1:6指1g的莪術粉加入6倍的水量，1:8、1:10、1:12亦如此。實驗結果如表4-3所示，實驗表明料液比為1:6時的提取率為0.90%，1:8時的提取率為1.78%，1:10時的提取率為1.76%，1:12時的提取率為1.74%，隨著料液比的增加，揮發油在水中的的濃度降低，可減少藥材粉末對揮發油的吸附，有利于揮發油的提取，使揮發油提取率也增加，但當比例到達1:10時，隨著料液比的增加，揮發油提取率增加的幅度并不明顯，故為節約資源，在優化提取的過程中我們選擇加入8倍水量。4.2.3加熱溫度的優化結果表4-4溫度對提取率的影響溫度（℃）得油量（mL）提取率（%）顏色1000.901.29棕黃色1101.281.83棕黃色1201.261.80墨綠色1301.301.86黑褐色實驗結果如表4-4所示，實驗表明100℃提取率為1.29%，110℃提取率為1.83%，120℃提取率為1.80%，130℃提取率為1.86%；經過多次的調溫提取發現：當溫度調節在110℃時，所提取的莪術油為棕黃色，氣味芳香，醒神通鼻；當溫度調節在120℃左右時，所提取的莪術油為墨綠色，微有糊焦味，且圓底燒瓶底部有結塊現象；當溫度調節在130℃時，所提取的莪術油為黑色，味道刺鼻發臭，且圓底燒瓶底部糊焦，猜測此時揮發油的化學成分發生了一定的變化；而當溫度低于100℃，提取率較低，耗時較長，浪費資源。由于溫度對揮發油的質量影響較大，使某些成分不可逆地分解轉化為其他成分，故在此實驗優化提取的過程中我們優先考慮提取溫度為110℃，以提取品質良好、化學成分穩定的莪術油。圖4-1棕黃色(110℃)圖4-2墨綠色(120℃)圖4-3黑褐色(130℃)4.3抑菌試驗結果單方精油對三種供試菌抑菌作用的實驗結果如表4-5所示：表4-5單方精油對供試菌的抑菌圈直徑大小供試菌抑菌圈直徑（mm）莪術油藿香油茶樹油迷迭香尤加利檸檬草歐薄荷天竺葵金葡117.9610.8310.2713.7813.9717.469.599.78金葡217.6810.4310.4815.6414.3217.539.549.82金葡317.7310.6710.4514.9814.2617.549.659.80曲霉111.7815.95--13.576.837.729.63曲霉212.8816.62--13.637.247.819.56曲霉314.9416.55--13.567.257.849.60大腸1大腸2大腸3表4-6單方精油對供試菌的抑菌圈平均直徑大小供試精油抑菌圈直徑（mm）莪術油金黃色葡萄球菌曲霉菌大腸埃希氏菌莪術油17.79±0.21+++13.20±2.27++-藿香油10.64±0.28++16.37±0.52+++-茶樹油10.40±0.16++--迷迭香精油14.80±1.32++--尤加利精油14.18±0.51++13.59±0.05++-檸檬草精油17.51±0.06+++7.11±0.34+-歐薄荷精油9.59±0.08+7.79±0.09+-天竺葵精油9.80±0.03+9.60±0.05+-注：“-”表示為對供試菌不起抑菌作用，“+”“++”“+++”表示精油對細菌的敏感程度。實驗表明：(1)所有的單方精油對金黃色葡萄球菌菌均起抑菌作用，其中莪術油和檸檬草精油顯高度敏感作用，茶樹油、迷迭香精油、尤加利精油顯中度敏感作用，而歐薄荷精油和天竺葵精油顯低度敏感作用；(2)除了茶樹精油和迷迭香精油對曲霉菌不起抑菌作用外，其他精油對曲霉菌均起一定的抑菌作用；其中，莪術油和尤加利精油顯中度敏感作用，檸檬草精油、歐薄荷精油、天竺葵精油顯低度敏感作用，而藿香精油則顯高度敏感作用；(3)所有的單方精油在大腸埃希菌培養基中都不顯抑菌圈現象，初步判斷所有精油對大腸埃希菌都不起抑菌作用。采用控制變量法探究莪術油含量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%時對金黃色葡萄球菌、曲霉菌兩種供試菌抑菌作用的影響。在僅改變莪術油的含量（橄欖油作為該配方中的基礎油視為無關變量，其在復方精油中的占比隨莪術油含量的改變而改變），在嚴格控制其他精油的量固定不變情況下，探究莪術油含量的高低對供試菌抑菌作用的影響，實驗結果如表4-7所示：表4-7各比例對供試菌的抑菌圈直徑大小莪術油含量(%)抑菌圈直徑金黃色葡萄球菌曲霉菌12312308.038.127.927.397.527.437.477.517.4648.288.288.227.597.647.5768.398.428.367.797.877.9288.568.578.497.978.127.97109.769.289.378.348.298.32128.068.428.39表4-8各比例對供試菌的抑菌圈平均直徑大小莪術油含量抑菌圈平均直徑（mm）金黃色葡萄球菌曲霉菌0%8.02±0.14+7.44±0.10+2%8.14±0.01+7.48±0.04+4%8.26±0.05+7.60±0.05+6%8.39±0.04+7.86±0.09+8%8.54±0.06+8.06±0.14+10%9.47±0.60+8.21±0.19+12%8.23±0.26+8.32±0.16+注：其他精油的固定配比參考了市場上幾種復方莪術油的成分含量以及文獻研究所得。圖4-1曲霉菌的抑菌結果圖4-2金葡萄球菌的抑菌結果注：標記a為單方莪術精油，b莪術油含量為6%，c莪術油含量為8%,，d莪術油含量為為10%，e莪術油含量為為12%。實驗表明：(1)復方精油經過不同比例的配比后對金黃色葡萄球菌和曲霉菌都顯低度敏感作用，和各種單方精油對比，其敏感度均有不同程度的下降，對皮膚的刺激性減弱；(2)在保證其他精油不變的情況下改變莪術油的用量，隨著莪術油的含量增加，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用也增加，當所加的莪術量為12%時，抑菌作用反而有所下降，其抑菌效果顯示和4%的用量相當；(3)隨著莪術油的含量增加，對曲霉菌的抑菌作用持續增加。4.4復方莪術油的質量評價結果4.4.1外觀性狀描述結果為復方莪術精油外觀澄清透明、微有香氣、黏度舒適均勻、為淡黃色的液體。4.4.2離心實驗離心結果為：離心后所得復方莪術油外觀澄清透明，無分層、絮狀物、沉淀、渾濁等現象，表明復方莪術油經高速離心后能保持穩定。4.4.3體驗反饋表4-9上藥時間對紅腫部位的影響組別直徑大小(mm)上藥前上藥1min上藥2min上藥3minA組0.930.950.920.870.870.900.910.830.490.570.560.521.561.431.010.821.331.41.411.290.530.470.470.430.720.730.670.530.710.640.450.341.481.431.411.032.640.672.420.672.070.511.760.49B組0.961.071.371.370.480.480.460.331.030.450.340.730.730.671.371.381.41.390.910.900.910.921.491.471.471.470.370.370.350.34使用SPSS22數據分析系統處理數據，結果如表4-10所示：表4-10成對樣本檢驗組別成對差分tSig.(雙側)均值標準差均值的標準誤差分的95%置信區間下限上限A組上藥前–A組上藥3min0.294000.310710.098250.071730.516272.992260.01515A組上藥1min–A組上藥3min0.252000.233370.073800.085060.418943.414700.00769A組上藥2min–A組上藥3min0.146000.116260.036760.062840.229163.971330.00325在A組中，通過對比上藥前與上藥后3min叮咬部位的直徑大小發現P=0.02<0.05，拒絕原假設，認為使用復方莪術油前與使用后3min存在顯著差異；通過對比上藥后1min與上藥后3min叮咬部位的直徑大小發現P=0.01<0.05，拒絕原假設，認為使用復方莪術油1min后和3min后存在顯著差異；同理比較上藥后2min和3min叮咬部位的直徑大小發現P=0.003<0.05,認為使用復方莪術油2min和3min后存在顯著差異。而在B組實驗中，發現P>0.05，線性相關程度較弱，沒有顯著的線性變化。5實驗結論經實驗證明，提取莪術油的最佳條件為：粒徑大小過30目，料液比為1:8，加熱溫度在110℃。在其他精油配比一定的情況下，加入10%的莪術精油配成的復方莪術油配比為橄欖油(80%)莪術油(10%)藿香油(2%)茶樹油(2%)歐薄荷油(2%)迷迭香油(1%)尤加利油(1%)天竺葵油(1%)檸檬草油(1%)所得的對金黃色葡萄球菌和曲霉菌的抑菌效果最佳，且穩定性良好。由有效量的莪術油與其他精油復合搭配使用，具有行氣活血、消積止痛、活血化瘀、去腐生肌增強機體免疫的功能,且具有良好的殺菌抑菌作用。液體橙黃透明，攜帶、使用方便,局部無刺激性,不影響皮膚正常生理功能。實驗表明，在使用復方莪術油后，對紅腫部位的直徑大小具有正相關作用，其對叮咬部位的直徑大小的影響明顯強于蒸餾水組，且數據分析表明用藥后3min能有效防止紅腫部位的直徑大小增大，發揮明顯的藥效作用，具有消腫止癢的功效，并且在一定程度上能趨蚊蟲叮咬，緩解紅腫熱痛的癥狀。6實驗討論6.1莪術油的制備及優化本實驗研究發現，不同批次、不同季節購買的生藥莪術，在同樣的提取條件下提取的莪術油的顏色、氣味、提取率均有些許差異，市場上部分的藥材在加工過程中可能會熏硫、醋制等使藥材失去其本身原始的特征、或以其他產地的藥材冒充道地藥材使得提取的揮發油紫色、混有難聞味道等影響揮發油的質量，故在挑選藥材時嚴格把關，挑選優質的廣西莪術。藥材的粉碎粒度、浸泡時間、料液比、蒸發量與蒸發速度等都會影響揮發油的提取率，且在大量生產中，揮發油的提取率相對較低，若想大規模生產莪術油，在生產設備及環境允許的條件下，應選用超臨界流體萃取(SFC)提取。在王地[24]研究中發現，正交試驗提取莪術油最佳的工藝條件為：粉碎度40~80目，加水量40倍，蒸餾時間2h，與本實驗的實驗結果相差較大，經分析后發現，王地的研究中，其粉碎度幅較小，而加水量增幅相對較大，而本實驗粉碎度幅較大，加水量增幅較小，因此得出的實驗結果相差相對較大。后期可細化篩選條件，適當地改變粉碎度福和水量增幅，進一步探究最佳的提取工藝。6.2抑菌實驗在黃輝鋒[25]的研究中表明莪術油對大腸埃希菌也有一定的抑制作用，在經過了反復的實驗發現，不僅莪術油對大腸埃希菌沒有抑菌作用，而且其他精油對大腸埃希菌也沒有預想的實驗結果。造成上述的原因可能有二：(1)所接種的大腸埃希菌活性失活，在培養基中根本沒有存活的細菌，莪術油乃至其他精油對大腸埃希菌有抑菌作用也無法體現出來；(2)在王影[22]的研究中發現大腸埃希菌極易產生耐藥性，可通過重復用藥或者基因突變、基因轉移產生。但本實驗在做了大腸桿菌的產氣實驗的背景下斷定：供試菌仍能產氣，并沒有失活，故推斷此菌種可能經過多代繁衍復制后發生基因突變、產生耐藥性，使莪術油等其他精油對其的抑菌作用可能消失。參考文獻國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015年版一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社,2015:274-275.朱凱.中藥廣西莪術的化學成分研究[D].沈陽藥科大學,2008.展曉日,曾昭武,孟凡莉,等.莪術油藥學研究進展[J].杭州師范大學學報(自然科學版),2011,10(05):454-458.王德立.中藥莪術研究進展[J].安徽農業科學,2014,42(11):3240-3258.王琰,王慕鄒.中藥莪術的質量研究[C]全國藥物分析優秀論文交流會.1999.李瑤,吳建華,謝艷華.莪術油的研究進展[J].陜西中醫藥大學學報,2017,40(03):118-121.ShinobuGocho,J.Antibact,AntifungAgents.1988,19(7):329-34.StammatiA,BonsiP,ZuccoF,etal.Toxicityofselectedplantvolatilesinmicrobialandmammalianshort-termassays[J].Food&ChemicalToxicology,1999,37(8):813-823.陳斌,孫克偉,劉明德,等.莪術對免疫性肝纖維化大鼠肝細胞膜功能的影響[J].湖南中醫藥大學學報,2003,23(1):7-8.劉葆琴,劉雅伶.百種中藥不同溶媒浸出液的熒光鑒別[J].醫教研究,1991(1):26-28.曾慶錢,蔡岳文,嚴振,等.廣藿香精油的殺蟲作用及其活性成分分析[J].植物資源與環境學報,2006,15(3):21-25.成珍.初榨橄欖油中酚醛抗菌、抗氧化和抗炎的研究進展[J].食品科技,2014(2):182-185.吳鵬昌,張偉.茶樹油的研究進展[J].中國藥業,2009,18(3):61-63.謝陽姣,時顯蕓,何志鵬.迷迭香研究進展[J].安徽農業科學,2010,38(6):2951-2952.陳彥樺.藍膠尤加利精油與茉莉花精油對五專女生登階運動后心率恢復之影響[J].實證自然醫學,2013,1(1):5-14.佟棽棽.迷迭香和檸檬草的揮發性成分及其抗抑郁、抑菌作用的研究[D].上海交通大學,2009.劉穎.薄荷有效物質基礎研究[D].北京中醫藥大學,2005.孫偉.香葉天竺葵精油的植物生物學及其藥理研究[D].華東師范大學,2005.李毅.金黃色葡萄球菌及其腸毒素研究進展[J].中國衛生檢驗雜志,2004,14(4):392-395.衛昱君,王紫婷,徐瑗聰,等.致病性大腸桿菌現狀分析及檢測技術研究進展[J].生物技術通報,2016,32(11):80-92.王影,李欣南,韓鐫竹,等.大腸桿菌耐藥性產生與傳播機制研究現狀[J].現代畜牧獸醫,2016(1):32-37.孔華忠.介紹幾種曲霉菌[J].植物雜志,1986(4):1-4+40-41.曾秋瓊,王逢源,張征,等.曲霉病診療進展[J].皮膚科學通報,2017(5):594-603.王地,關懷,于萍,等.莪術細粉提取揮發油的工藝研究[J].時珍國醫國藥,2007,18(6):1437-1438.黃輝鋒,鄭彩娟,陳光英,等.莪術油與藥渣殘油的化學成分和抗菌活性比較[J].中國實驗方劑學雜志,2015,21(20):67-71.

綜述植物精油的研究進展中藥揮發油又稱為精油，是一類在常溫下能揮發的、可隨水蒸氣蒸餾的、與水不相混的油狀液體的總稱，廣泛存在于植物藥的各個部位。近年人們對揮發油的藥理活性進行了更多的研究，發現揮發油具有抗過敏活性、酶抑制活性、抗炎活性、抗突變和抗癌活、，抗微生物活性、抗病毒活性、驅蟲活性、抗氧化活性及鎮靜中樞神經等諸多藥理活性和用途[1]。如篙子油、丁香烯、梓檬草油對GST具有抑制作用;也有學者發現揮發油具有抗腫瘤、抗病毒、殺蟲抗菌、降壓、消炎、平喘、止咳等作用[2]；對皮膚和結締組織、神經系統、淋巴循環、動靜脈循環系統、腦脊髓神經組織、臟腑及內外分泌腺及心理健康均有醫療保健功效[3]，廣泛應用于醫藥行業，比如大家都比較熟悉的用于跌打損傷的白花油、紅花油，用于治療痤瘡的茶樹精油等等。而日常生活中，精油多有適宜的香味,作為添香劑、醫藥中的香料[4]或有效成分添加應用于日用品和化妝品種，最常見的就是香水、花露水等;也會利用其揮發性強的特點，通過鼻腔、呼吸道、皮膚等進入人體，達到舒緩精神，消腫祛痛的功效，醫學之父希波克拉底曾在古雅典遭受瘟疫襲擊時，讓民眾在街頭燃燒有香味的植物，利用植物的揮發性成分，殺死空氣中的細菌，防止瘟疫擴散[5]。我國國地大物博、植物藥種類繁多，植物藥精油資源相當豐富，為植物精油的開發利用提供了有利的條件。但是，精油作為植物精華提取物，濃度較高，直接使用多少存在皮膚刺激性，造成精油在日常中應用的限制，且功效單一，所含成分復雜，張麗艷[6]等人對此還創新性地提出了利用中藥配伍的原理對具有這一類作用的植物進行復配以達到增效減毒的目的。利用多種精油復合配比，制得用途廣泛，既天然低刺激，又外觀適宜、性質穩定的精油成分的復方莪術油，具有相當市場前景且滿足廣大人群需求，與市面上出現的莪術油有一定的競爭力。1精油的提取方法提取植物精油的方法有很多，目前主要采用水蒸氣蒸餾法、浸取法和冷壓法進行提取[7]。采用浸取法提取是，根據溶媒不同，又分為油脂吸附法、溶劑萃取法和超臨界流體萃取法[8]。在對植物精油成分及活性進行研究時，常采用水蒸氣蒸餾法、溶劑萃取法及超臨界流體萃取法提取精油。其中尤以水蒸氣蒸餾和超臨界流體萃取為最佳，所獲精油提取率和純度均較其他方法高。但由于超臨界流體萃取法設備屬高壓設備，投資較大，在實驗室中廣泛使用仍有一定的局限，故在實驗室中我們多用水蒸氣蒸餾法提取。水蒸氣蒸餾法提取植物精油的基本原理是油水共沸。植物精油中有許多成分，沸點各不相同，其中多數成分的沸點在100℃左右。水蒸汽蒸餾法就是利用了精油的這一特點，使與植物汁液混合的水在化成水蒸汽時帶著精油分子一起蒸發出植物表面，然后經冷卻回流到油水分離器中，精油與水自然分層，精油浮于水層上。圓底燒瓶中損失的水分也會隨著冷凝回流的過程而得到補充，如此循環操作以提取藥材中大部分的揮發油，但最大的缺點就是溫度過高，油水接觸時間較長，揮發油成分容易遭到破壞。2精油的抑菌研究概述近幾年的研究表明，許多植物精油殺菌譜廣，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、病原真菌等均有一定的殺菌活性。其殺菌廣譜性以及強殺菌活性使其能夠開發層為消毒殺菌藥劑。侯華民、張興等人研究了植物精油的熏蒸殺菌效果[9]，發現植物精油具有開發成為消毒劑的潛力。廣州浩盈貿易有限公司以幾種中藥植物精油為原料研發成功空氣消毒劑[10]，可以應用于醫院、爐管、飯店、家庭居室以及人群密集的公共場所消毒，其效果與家庭紫外小消毒法、過氧乙酸熏蒸法相當。相比其他消毒方法和消毒藥劑，植物精油氣味芳香，對皮膚和粘膜刺激性小，具有很好的發展前景。再者，植物精油無論是一單種植物精油還是以多種植物精油混合物作為制劑，它們都具有良好的抑菌活性。另外，許多植物精油具有多種生物活性，即具有殺蟲活性，也具有抑菌活性。植物精油的這些特點為其開發利用提供了有利的條件。但植物精油中化學成分復雜多樣，而真正具有抑菌作用的化合物可能僅為其中一種或其中，各化合物間也可能存在復雜的拮抗或增效作用，這就需要對精油中的活性化合物進行分離并鑒定其結構，為復合精油的開發提供必要的資源。抑菌實驗用于測定抑菌劑在體外抑制微生物生長的效能。雖然已報道的抑菌方法有很多,但是由于操作中的影響因素很多如植物的類型、精油提取方法的多樣性、菌體的差異性、培養基的差異性及培養條件的不同等等,因此現在還沒有一個統一的實驗操作標準。目前,精油體外抑菌的實驗方法大體上分為瓊脂擴散法和稀釋法兩種。瓊脂擴散法是抑菌實驗中最常用的方法[9]。瓊脂擴散法就是利用化合物可以在瓊脂中擴散,使化合物擴散到的地方的微生物生長受到抑制,從而出現透明圈,初步判斷該化合物有無抗菌活性.原理相同只是化合物載體不同.大致分為三種：濾紙片法、牛津杯法和瓊脂炔法。2.1濾紙片法將化合物溶劑滴加到濾紙片上,然后將濾紙片貼到涂有微生物的固體培養基上,使化合物擴散。2.2牛津杯法先在平皿底部倒一薄層水瓊脂,等凝結后放上牛津杯,再倒入混有微生物的培養基,凝固后將牛津杯取出,是培養基上形成孔,然后將化合物溶解加入到孔中,使之擴散。2.3瓊脂塊法待微生物在固體培養基上生長好后,將具體下方的瓊脂切塊取下,放到涂有微生物的固體培養基上,使化合物擴散.3植物精油的發展前景很多學者在植物精油的理化性質、生物活性、作用機理等方面已做了不少工作,今后植物精油產業化的發展不應僅僅局限于傳統的醫藥、食品、日用化學等某一領域或某一方向應用,應走多學科、多方向