牙源性角化囊腫和成釉細胞瘤體外培養大鼠骨吸收機制研究

角質性角質化（obc）和成形細胞瘤（obc）是牙科疾病的常見損傷。這種生長具有局部入侵，通常會導致下頜骨的吸收和破壞。這些病損在頜骨內生長、增大,具有誘導局部骨吸收的能力。早期研究多集中在骨內病變體積的增大對周圍骨組織的物理性壓迫作用,骨組織具有受壓力而吸收增強的生物學特點。近年來隨著對骨吸收調控和骨代謝方面研究的不斷深入,人們越來越重視病變微環境中細胞間的相互作用,腫瘤或病變細胞一般不直接引起骨組織的破壞,而是通過產生或誘導其他細胞產生骨吸收刺激因子間接影響破骨細胞的分化、成熟和功能活性。因此,牙源性病損局部侵襲性的強弱可能取決于其病變細胞活化破骨細胞及誘導骨吸收的能力。目前,已明確可參與骨吸收調控的相關因子很多,其中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等可促進骨吸收,而降鈣素(calcitonin,CT)和骨鈣素(boneGla-containingprotein,BGP)等則是促進骨形成的相關因子。我們采用體外培養技術檢測OKC和成釉細胞瘤的體外骨吸收效應,并采用放射免疫方法定量分析牙源性病損的體外培養上清液中上述幾種骨吸收調控因子的含量。材料和方法1.-mem培養基本實驗選用的SD大鼠(新生5天)購自國家計劃生育委員會動物室;α-MEM培養基購自美國Hyclone公司;所用IL-6、TNF-α、PGE2、BGP和CT放射免疫測定藥盒均購自中國人民解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。2.細胞培養和轉染無菌收集手術切除的25例牙源性囊腫(OKC14例、OKC伴感染6例、含牙囊腫5例)和7例成釉細胞瘤標本,組織塊立即放入D-Hanks液中漂洗3次,再置入α-MEM培養基(含15%胎牛血清,1×10-5U/L青霉素,1×10-5U/L鏈霉素,25mmol/LHEPES)中漂洗3次,將標本剪切為約1mm×1mm×1mm大小,置于5mlα-MEM培養基中培養24h(37℃,5%CO2),收集培養上清液凍存于-80℃冰箱中備用。用濾紙吸干培養基中的組織塊、稱重,計算并記錄各組織塊的重量和培養基體積的比值(g/L)。3.細胞培養及ca2+含量檢測乳鼠顱蓋骨器官培養及其上清中Ca2+測定采用經典的體外檢測骨吸收的方法,完整取出SD大鼠顱蓋骨,于D-Hanks液中去除附著于其表面的骨膜及其他軟組織,沿冠狀縫分離左右側顱蓋骨,經24h預培養(37℃,5%CO2)后,轉移至24孔培養板(半側顱蓋骨/孔),各孔含0.4mlα-MEM培養基和0.1ml待測的組織塊培養上清(以10g/L的重量體積比值稀釋所有樣本),空白對照組僅加0.5mlα-MEM培養基,陽性對照組加0.5ml含10μg/LIL-1β和TNF-α的α-MEM培養基,繼續培養48h后,收集培養上清液300μl并采用原子分光光度計檢測其Ca2+含量。4.脈沖活性測定分別收集各組牙源性病損體外培養上清液800μl,按照試劑盒提供的操作加液程序,分別與緩沖液、標準液、抗體及已知濃度的標記抗原(125I/3H標記)充分作用,于4℃、3500r/min離心25min,棄去上清液,在γ計數器(SN-695B型,上海)或液體閃爍計數器(LS-6500型,USA)上測定脈沖數/放射活性比值,再于標準曲線上求出待測樣本濃度。5.牙源活檢塊的組織學觀察每例牙源性病損的一部分均行常規組織學染色以明確診斷。經體外培養24h后的牙源性病損組織塊也行常規組織學處理,以觀察其形態變化。免疫組化染色采用鏈親和素-過氧化物酶技術,分別對廣譜角蛋白(AE1/AE3)、角蛋白19(CK-19)和波形蛋白等標記物進行檢測。6.骨吸收相關因子含量的影響各病變組與乳鼠顱蓋骨共同培養的上清液中Ca2+含量,以及各組培養上清液中TNF-α、IL-6、PGE2、BGP和CT的放免檢測含量的組間差異,采用SPSS10.0統計軟件的Kruskal-wallis法進行非參數H檢驗,并對各組骨吸收相關因子含量與Ca2+含量的相關性進行相關回歸分析。牙源病理變化對血清ca2+和tnf-的影響OKC和成釉細胞瘤標本在體外培養24h后,其組織結構和細胞形態均無明顯改變,廣譜角蛋白、角蛋白19以及波形蛋白的免疫組化染色也證實培養后病變組織上皮和結締組織的免疫組化表達無明顯改變(圖1~4),故將牙源性病變組織塊的體外培養時間定為24h。Kruskal-wallisH檢驗表明:陽性對照(IL-1β和TNF-α)組及各病損組的Ca2+析出濃度均顯著高于空白對照組(P<0.01),其中OKC伴感染組顯著高于OKC組和成釉細胞瘤組(P<0.05),其余各病損組之間差異無統計學意義(表1)。各組牙源性病損培養上清中骨吸收因子的放射免疫測定值見表2。Kruskal-wallisH檢驗結果顯示:IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均顯著高于空白對照組(P<0.05),而BGP含量與空白對照組之間差異無統計學意義(P>0.05);各病變組之間的比較顯示:OKC組和OKC伴感染組的IL-6含量顯著高于成釉細胞瘤組(P<0.05);OKC伴感染組CT含量顯著高于OKC組和含牙囊腫組(P<0.05);其余各組之間差異無統計學意義(P>0.05,表2)。對所有檢測樣本的Ca2+含量和各種骨吸收相關因子水平的相關回歸分析證實:樣本中的IL-6水平與Ca2+析出量密切相關,差異有統計學意義(r=0.552,P<0.01)。骨吸收效應檢測OKC和成釉細胞瘤在頜骨內可沿骨小梁間隙向周圍浸潤性生長,引起骨組織破壞和吸收,這種生物學行為很可能與病變細胞可產生或誘導產生多種骨吸收刺激因子,并在病變局部造成骨吸收亢進有關。以往研究多涉及炎癥性牙源性囊腫,證實其在體外具有骨吸收效應。對牙源性發育性囊腫(如OKC和含牙囊腫)及成釉細胞瘤的體外實驗研究較少。本實驗采用牙源性病損組織塊體外培養與乳鼠顱蓋骨體外培養相結合的方法,比較了幾種牙源性病損的培養上清液引起乳鼠顱蓋骨在培養體系中Ca2+的釋放量,以比較不同病損在體外的骨吸收效應。結果發現:各組牙源性病損均可顯著增加培養體系中的Ca2+釋放量,提示各組牙源性病損在體外均具有促進骨吸收的作用,其中OKC伴感染組的體外骨吸收效應顯著高于OKC組和成釉細胞瘤組,這可能與囊壁組織受炎癥刺激產生多量的細胞因子有關,提示炎癥及炎癥介質在骨吸收中可能起重要作用。Harris等、Bando等和Gervasio等分別采用波層色譜、免疫組化和ELISA等方法,證實根尖囊腫的骨吸收效應與PGE2、IL-6和TNF-α等骨吸收因子密切相關。本實驗采用更為靈敏的放射免疫測定法定量檢測牙源性病損培養上清液中多種骨吸收相關因子的含量,結果表明:各組牙源性病損的培養上清液中IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均顯著高于空白對照組,其中OKC組和OKC伴感染組的IL-6水平均顯著高于成釉細胞瘤組,但與含牙囊腫組相比差異無統計學意義,提示發育性牙源性囊腫所導致的骨吸收可能與IL-6水平增高有關。相關分析也證實:IL-6水平與骨吸收效應指標Ca2+含量密切相關,提示在被檢測的幾種骨吸收因子中,IL-6可能對牙源性病損所致的骨吸收發揮更主要的作用。由于本實驗中牙源性病損的培養上清液與乳鼠顱蓋骨體外共孵育的時間有限(48h),這些細胞因子誘發骨吸收的機制可能與活化成熟的破骨細胞有關,是否可同時影響病變微環境中破骨細胞的分化或形成尚待進一步探討。成釉細胞瘤導致頜骨破壞、吸收的機制可能有別于牙源性囊腫,其臨床上的高侵襲性可能還與腫瘤的