新型氟喹諾酮藥物與牛血清白蛋白的相互作用機制

伊諾沙星（eno沙星）是一種新型的第三代氟脲諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾基諾。藥物進入體內后要通過血漿貯存與運輸才能到達受體部位產生藥效作用,因此,從不同角度考察藥物分子與蛋白質的作用對于了解藥物的轉運和代謝過程、蛋白質的結構與功能之間的關系以及闡明生物大分子與藥物小分子相互作用的化學本質都具有重要的意義。目前,常見的有關依諾沙星的研究主要集中在藥物動力學和藥物的分析測定等方面,有關依諾沙星與生物大分子的相互作用研究還未見報道。本文應用熒光光譜法較全面地研究了生理pH條件下依諾沙星與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用機制,利用依諾沙星對牛血清白蛋白熒光強度的猝滅,求出依諾沙星與牛血清白蛋白的結合常數和結合位點數,計算出二者之間的作用力大小。根據F?rster非輻射能量轉移機制,測定了實驗條件下依諾沙星與牛血清白蛋白相互結合時能量給體-受體間的作用距離和能量轉移效率,并用同步熒光光譜技術考察了依諾沙星對牛血清白蛋白構象的影響,為進一步研究依諾沙星的藥物作用機理提供了參考。1實驗部分1.1前處理的質量標準日立F＿4500型熒光分光光度計(日本日立),U＿3010型紫外可見分光光度計(日本日立),pHS＿3C型酸度計(上海天達儀器有限公司),HH＿2數顯超級恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。依諾沙星標準溶液(5.235×10-3mol/L):準確稱取0.1677g依諾沙星對照品(中國藥品生物制品鑒定所)溶于少量稀NaOH溶液中,再加水定容于100mL容量瓶中,置冰箱中貯存,使用時再逐級稀釋。牛血清白蛋白標準溶液(1.05mg/mL):準確稱取0.1050g牛血清白蛋白(中國醫藥集團上海化學試劑公司)溶于少量水中,再定容于100mL容量瓶,貯存于0～4℃的冰箱中,使用時逐級稀釋。緩沖溶液:用1∶1(體積比)的鹽酸滴加到0.1mol/L的Tris溶液中,在pH計上調成pH7.40的Tris-HCl緩沖溶液。其它所用試劑均為分析純,實驗用水均為亞沸水。1.2熒光測定和亞水浸定容液水質在10mL容量瓶中按順序加入105μg/mL的牛血清白蛋白0.5mL,一定量2.094×10-5mol/L的依諾沙星標準溶液,0.1mol/L的NaCl溶液1mL(用以維持體系中的離子強度)及pH7.40的Tris-HCl緩沖溶液2mL,以亞沸水定容至刻度,搖勻靜置10min后進行熒光測定。液池厚為1cm,激發光波長λex=280nm,激發和發射狹縫寬度均為5nm。在10mL容量瓶中加入0.8mL2.094×10-5mol/L的依諾沙星標準溶液,再加入0.1mol/L的NaCl溶液1mL和pH7.40的Tris-HCl緩沖溶液2mL,用亞沸水定容至刻度,搖勻靜置10min后進行吸光度測定。2結果與討論2.1熒光發射強度蛋白質分子中由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在使其具有內源性熒光。牛血清白蛋白的最大激發波長為280nm,最大熒光發射波長為351nm。依諾沙星的加入使牛血清白蛋白的熒光發射強度發生明顯的猝滅,表明兩者之間存在相互作用,發生了能量轉移,如圖1。而BSA的存在并未使ENX的熒光強度增強,說明它們之間的能量轉移屬于非輻射能量轉移過程。2.2不同溫度下bsa的符合性熒光分子與其它分子相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅,可分為動態猝滅和靜態猝滅。對于靜態猝滅過程,熒光強度與猝滅劑的關系可由熒光分子與猝滅劑分子之間的結合常數表達式求出:(1)式中IF0和IF分別表示加和未加猝滅劑時體系的熒光強度。固定BSA的總濃度,改變藥物ENX的濃度c(Q),以lg[(IF0-IF)/IF]對lgc(Q)作圖可得一直線,由該直線的斜率和截距即可確定結合常數K和結合位點數n。本文分別在16℃和26℃時,實驗了體系的熒光發射光譜隨藥物ENX濃度的變化情況。結果得出,依諾沙星的加入使BSA的熒光強度有規律地猝滅,而最大發射波長未發生明顯的變化。以最大發射波長351nm處的熒光強度按(1)式處理,分別得出16℃和26℃兩個溫度下的線性方程lg(IF0-IF)/IF=3.95+0.89lgc(ENX)和lg[(IF0-IF)/IF]=3.24+0.74lgc(ENX),線性相關系數分別為r1=0.9998和r2=0.9959。由直線的截距和斜率可求得兩個溫度下,依諾沙星和牛血清白蛋白作用的結合常數K1=9.0×103L/mol和K2=1.73×103L/mol,結合位點數分別為n1=0.89和n2=0.74。由實驗結果可以看出,隨著溫度的升高,BSA的猝滅程度降低,初步證明為靜態猝滅。為進一步證實此猝滅過程,將此過程按動態過程處理如下:動態猝滅過程關系式為IF0/IF=1+Ks·c(Q)=1+Kq·τ0·c(Q)(2)Kq為雙分子猝滅過程速率常數,Ks為動態猝滅常數,τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命,c(Q)為猝滅劑濃度。Ks=Kq·τ0,則Kq=Ks/τ0。由于生物大分子熒光壽命約為10-8s,故可按(2)式進行處理,分別得出16℃和26℃時的動態猝滅常數為Kq1=3.149×1016和Kq2=1.022×1016,線性相關系數分別為rq1=0.999和rq2=0.991,而各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數為2.0×1010。可見,按動態猝滅過程處理,所得依諾沙星對牛血清白蛋白的熒光猝滅常數遠遠大于擴散控制的Kq極值,所以進一步反證了以上猝滅為靜態猝滅。2.3病理組織學檢測藥物小分子與生物大分子的作用力包括靜電作用力、氫鍵作用力、范德華作用力和疏水作用力等。不同藥物與蛋白質結合的作用力類型也不相同。當溫度變化不大時,結合作用的焓變ΔH可以近似看作一個常數。根據2.2中兩個溫度下的結合常數,由ln(K2/K1)=(ΔH/R)(1/T1-1/T2),ΔG=-RTlnK,ΔG=ΔH-TΔS三式求出26℃時依諾沙星與牛血清白蛋白作用的熱力學參數ΔHm=-51.44kJ/mol,ΔGm=-8.05kJ/mol,ΔSm=-0.145kJ/(mol·K)。Ross等根據大量的實驗結果,總結了判斷生物大分子與小分子結合作用力類型及生物大分子自身作用力類型的熱力學規律,即疏水作用力使體系的ΔH和ΔS變正,氫鍵或范德華作用力使體系的ΔH和ΔS變負,靜電作用力使體系的ΔH≈0、ΔS>0。從上述結果可以看出,依諾沙星與牛血清白蛋白之間的作用力主要是氫鍵和范德華作用力。2.4bsa的熒光光譜根據F?rster非輻射能量轉移理論,臨界能量轉移距離R0和轉移的量子效率E由以下兩式給出:式中R0是E=50%時的臨界距離,K2為偶極空間取向因子,N為介質的折射指數,Υ為熒光能量給體在沒有受體存在情況下的熒光量子效率,J為給體(蛋白質)熒光發射光譜與受體(藥物)吸收光譜間的光譜重疊積分:其中F(λ)為熒光給體在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸收系數。能量轉移效率E可按下式確定:E=1-IF/IF0(5)圖2為BSA與依諾沙星物質的量比為1∶1時,BSA的熒光光譜和依諾沙星的吸收光譜的重疊圖。用矩形分割法求該圖中光譜重疊部分的面積,得重疊積分J=4.13×10-13cm3·L·mol-1。BSA的內源熒光主要由色氨酸殘基所產生。在上述實驗條件下,取向因子取熒光給體-受體各向隨機分布的平均值K2=2/3,BSA中色氨酸殘基熒光量子效率Υ=0.118,折射指數取水和有機物平均值N=1.336,將上述數值代入(3)式求得臨界作用距離R0=3.11nm,再由(5)式求得能量轉移效率E=0.074,進而由R0和E按(4)式求出BSA中色氨酸殘基與依諾沙星分子間的作用距離r=4.74nm。2.5確定殘基的發射波長同步熒光光譜可用于蛋白質構象變化的分析,Δλ=60nm的同步熒光光譜表現出色氨酸殘基的熒光性質。因色氨酸殘基的最大發射波長與其所處的環境有關,故由發射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。固定激發和發射光波長的差值Δλ=60nm,保持蛋白質濃度不變逐漸增加依諾沙星的濃度作的同步熒光光譜,見圖3。由圖3可看出,隨著依諾沙星濃度的增大,BSA的同步熒光波長出現一定程度的紅移,說明藥物依諾沙星的加入使蛋白質的構象發生了