一、教學目標與要求

1要求學生了解IMViC試驗原理及在腸道菌判定中意義。2掌握IMCiV及硫化氫試驗操作。教課時數：6課時微生物生理生化實驗實驗第1頁二、試驗原理

★微生物體內各種酶系統控制復雜多樣生化反應完成；測定微生物一些酶類有沒有、對底物作用是否、反應條件、反應產物及代謝方式都屬于生理生化試驗內容。★在培養基內或在培養完成之后加入特定指示劑就可確定所發生生理生化反應類型。

★慣用試驗：糖代謝試驗、氨基酸和蛋白質代謝試驗、氮源和碳源利用試驗及酶試驗等。

微生物生理生化實驗實驗第2頁IMViC是四個生理生化反應英文詞第一個字母縮寫，I表示吲哚試驗（indoltest）、M表示甲基紅試驗（methylredtest）、V表示伏普反應（Voges-Proskauerreaction，小寫之i使之成為一個可發音單詞）、C表示檸檬酸鹽試驗（citratetest）。這四個試驗在腸道細菌判別中經常作為一組常規生理生化試驗來進行。微生物生理生化實驗實驗第3頁1、吲哚試驗（indoltest）

含有色氨酸酶細菌，能分解蛋白質中色氨酸產生吲哚（靛基質），吲哚本身沒有顏色，不為肉眼所見，當加入對二甲氨基苯甲醛試劑后，形成可見紅色化合物，即玫瑰吲哚微生物生理生化實驗實驗第4頁2、甲基紅試驗（methylredtest）

腸道細菌可分解葡萄糖產生丙酮酸，并使丙酮酸深入分解為甲酸、乙酸、乳酸等。對于一些細菌如大腸桿菌、沙門氏菌等，發酵葡萄糖產酸較多，使培養基pH下降到4.2甚至更低，所以可用指示劑甲基紅（反應范圍pH4.2紅～6.3黃）指示出來。3、伏普反應（Voges-Proskauerreaction

）

產氣桿菌能進行丁醇發酵，可使丙酮酸脫羧，生成中性乙酰甲基甲醇（3-羥基丁酮）可經過V.P試驗檢測出來。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇可被空氣中氧所氧化，生成二乙酰（丁二酮），二乙酰再與蛋白質中精氨酸胍基作用，生成紅色化合物，即為V.P反應陽性。微生物生理生化實驗實驗第5頁微生物生理生化實驗實驗第6頁檸檬酸鹽培養基是合成培養基，不含蛋白胨和糖類，檸檬酸鹽為唯一碳源。有細菌如產氣桿菌能利用檸檬酸鈉作為碳源，檸檬酸鈉為弱酸強堿鹽，被分解利用后使培養基pH值升高，由中性變為堿性，可使培養基中指示劑溴麝香草酚藍（反應范圍pH6.0～7.6，黃色～藍色）由綠變藍。4、檸檬酸鹽試驗（citratetest）

微生物生理生化實驗實驗第7頁三、試驗器材

恒溫水浴鍋，接種針，接種環，試管架，記號筆，滴管；蛋白胨水培養基，葡萄糖蛋白胨水培養基，檸檬酸鹽培養基（西蒙氏培養基）；甲基紅試劑，V.P試劑，吲哚試劑，40%KOH溶液（內含0.3%肌酸），乙醚，6%α-萘酚酒精溶液；大腸桿菌，產氣腸桿菌，枯草芽孢桿菌，普通變形桿菌。微生物生理生化實驗實驗第8頁四、試驗步驟

1、培養基制備（略，已準備）：蛋白胨水培養基，葡萄糖蛋白胨水培養基，檸檬酸鹽培養基2、培養基編號3、接種：按要求接種4、培養：37℃溫箱中培養

5、生理生化反應及觀察微生物生理生化實驗實驗第9頁（1）吲哚試驗培養后取出，先加入乙醚約1ml（使展現顯著乙醚層），充分震蕩后沿試管壁緩緩滴加吲哚試劑5-10滴，觀察有沒有紅色環出現。注意：加入吲哚試劑后不可再動搖!有紅色環出現者為陽性，反之為陰性（2）甲基紅試驗取出培養物，在培養液中加入幾滴甲基紅試劑（約每毫升培養液加指示劑1滴），馬上觀察結果，展現紅色為甲基紅試驗陽性，桔紅色為弱陽性，桔黃或黃色為陰性反應。微生物生理生化實驗實驗第10頁（3）V.P反應試驗

取出培養物2ml，加入與培養基等量V.P試劑，充分振蕩，放置37℃溫箱中30min，觀察。呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。

（4）檸檬酸鹽利用試驗取出培養物，觀察，培養基上有菌苔生長且變為藍色即為陽性反應；無菌生長、培養基仍為綠色者為陰性反應。凡陰性反應者，最好繼續培養觀察至第7d。微生物生理生化實驗實驗第11頁五、注意事項1.檸檬酸鹽利用試驗應預防瓊脂中雜質，同時制備培養基時應嚴格調整pH值。2.V.P反應要求在與空氣充分接觸下完成，所以加入試劑后須充分振搖。六、試驗統計菌種吲哚試驗MR試驗V.P反應檸檬酸鹽利用大腸桿菌產