免疫組化圖片

-3-211免疫組化和熒光專家講座第1頁免疫熒光圖片

-3-212免疫組化和熒光專家講座第2頁免疫組化與免疫熒光免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合原理，經過化學反應使標識顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素等)顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及定量研究，稱為免疫組織化學。用熒光抗體示蹤或檢驗對應抗原方法稱熒光抗體法；用已知熒光抗原標識物示蹤或檢驗對應抗體方法稱熒光抗原法；這兩種方法總稱免疫熒光技術，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結合，用于檢測或定位各種抗原，也能夠與其它蛋白質結合，用于檢測或定位抗體，不過在實際工作中熒光抗原技術極少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術，或稱為免疫熒光技術。-3-213免疫組化和熒光專家講座第3頁試驗原理免疫學基本反應是抗原-抗體反應。因為抗原抗體反應含有高度特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中一個原因，就能夠查出另一個原因。免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合原理，經過化學反應使標識顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原；免疫熒光技術是將不影響抗原抗體活性熒光色素標識在抗體（或抗原）上，與其對應抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下展現(xiàn)一種特異性熒光反應。-3-214免疫組化和熒光專家講座第4頁試驗步驟脫蠟水化：二甲苯Ⅰ20min二甲苯Ⅱ20min無水乙醇Ⅰ10min無水乙醇Ⅱ10min95%乙醇5min80%乙醇5min75%乙醇5min50%乙醇過一遍蒸餾水過三遍高壓修復4min流水冷卻PBS沖洗5min×3次3%H2O215min，37℃/(0.5%Triton5min)PBS沖洗5min×3次10%山羊血清封閉37℃，50min一抗4℃,過夜復溫37℃，1h

PBS沖洗5minx3次

二抗30min

PBS沖洗5minx3次

DAB顯色＜1min/(DAPI5min)

PBS沖洗(蓋片，觀察。)蘇木素復染1min自來水沖洗脫水，透明，封片。-3-215免疫組化和熒光專家講座第5頁

抗原修復——原因

*常規(guī)石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：

-抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；

-蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。

*要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成交聯(lián)破壞，而恢復抗原原有空間形態(tài)。方法：微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，慣用修復液是pH6.00.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液。-3-216免疫組化和熒光專家講座第6頁注意事項標本固定脫水、石蠟包埋和制片脫蠟和水化抗原修復細胞通透滅活內源性過氧化物酶和生物素血清封閉一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間抗體稀釋液切片清洗DAB顯色避光復染封片

①預防標本從玻片上脫落；②除去妨礙抗原-抗體結合類脂，使抗原抗體結合物易于取得良好染色結果；③固定標本易于保留。固定劑選擇普通用4%多聚甲醛脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時刀片要潔凈和尖銳。不然，輕易裂片和脫片等。為了后面抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。因為組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基封閉作用，從而失去抗原性；經過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提升抗原檢測率。使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。普通用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100能夠溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上脂質而使抗體及大分子結構物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這么抗體就能順利進入胞內與對應抗原結合。滅活內源性POD普通3%過氧化氫滅活時間短點，能夠10min左右，而0.3%過氧化氫則能夠適當延長封閉時間，普通10~30min；過氧化氫孵育時間過長易引發(fā)脫片組織切片上有剩下位點能夠與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果假陽性；封閉血清普通是和二抗同一起源，血清中動物本身抗體，預先能和組織中有交叉反應位點發(fā)生結合；但不能與一抗起源一致。普通室溫10-30min。一抗孵育條件在免疫組化反應中最主要，包含孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最正確；孵育時間：這與溫度、抗體濃度相關，普通37℃1-2h，而4℃過夜和從冰箱拿出后37℃復溫45min很好。二抗普通室溫或37℃30min-1h。抗體稀釋液用普通PBS即可，但專用抗體稀釋液中除PBS外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，反抗體屢次回收利用很好。正因為這種原因，抗體稀釋液PH值可能偏酸，而使抗原抗體反應不佳，終而出現(xiàn)假陰性結果。為了預防一抗、二抗等試劑殘留而引發(fā)非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增屢次數(shù)）尤為主要，普通在一抗孵育前清洗是3min*3次，而一抗孵育后清洗均為5次*5min。注意：①單獨沖洗，預防交叉反應造成污染。②溫柔沖洗，預防切片脫落。可用浸洗方式；③沖洗時間要足夠，才能徹底洗去結合物質。④PBSPH和離子強度使用和要求。背景深淺和特異性染色深淺均能夠由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定，特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗.預防熒光素提前衰退。目標是形成細胞輪廓，從而更加好地對目標蛋白進行定位，經慣用蘇木素復染。蘇木素復染時間要看當初室溫、溶液新舊、目標抗原定位等情況，普通數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白能夠適當初間長一點，而胞核蛋白則要短。普通用中性樹膠等封片，防止產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面那個拐角，靠近封片液近端拐角先降低，直至接觸到液體時為止-3-217免疫組化和熒光專家講座第7頁石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，能夠延長烤片時間和提升烤片溫度；

2）用含有多聚賴氨酸玻片；

3）有些組織本身就輕易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引發(fā)。-3-218免疫組化和熒光專家講座第8頁免疫組化常見問題處理

標本無染色①確認是否忽略了應該加某種試劑(一抗、二抗、三抗及底物等)。②確認全部試劑是否按正確次序加入，是否孵育了足夠時間。③對照抗體標簽確認是否使用了正確抗體，以及所用檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配。④檢驗抗體所使用稀釋度及稀釋溶液。⑤檢驗抗體使用期和保留條件，尤其是標識了酶或熒光素抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑企業(yè)抗體均要求在4~8℃條件下保留，應防止重復凍融，試劑保留時一定要防止與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體效價。⑥檢驗標本儲存條件，最好用已知陽性標原來同時做陽性對照。⑦檢驗沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液pH值很主要，與過氧化物酶底物匹配溶液中不應含有疊氮鈉。⑧檢驗復染劑和封片劑是否和所使用色原匹配。-3-219免疫組化和熒光專家講座第9頁弱陽性

①標本固定方式，不妥固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測抗原數(shù)量和質量。②不適當抗原修復方式，因為石蠟切片在制作過程中固定劑反抗原封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用抗原雙暴露法，至于使用哪一個方法，應參考生產廠家說明，同時結合標本詳細情況而定。③抗體稀釋度是否過高或者孵育溫度/時間是否正確。普通試劑生產廠家都會對試劑給出一定使用范圍，不過因為使用者標原來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參考使用范圍，對所使用一抗進行梯度測試，找出最正確使用濃度。④切片上遺留了過多沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地反抗體進行了深入稀釋。⑤孵育時切片是否放置水平，不然會造成抗體流失。假如陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是因為陽性對照不是同一個組織、或固定方式不一樣等原因所致。-3-2110免疫組化和熒光專家講座第10頁產生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可經過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，可試用單克隆抗體；

3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多組織），需要經過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4）非特異性組分與抗體結合，經過延長二抗起源動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

5）DAB孵育時間過長或濃度過高；

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗孵育之后浸洗要充分；

7）標本染色過程中經常出現(xiàn)干片，這輕易增強非特異性著色。-3-2111免疫組化和熒光專家講座第11頁免疫熒光常見問題處理非特異性染色產生原因及其處理方案：⑴游離熒光素殘留在二抗中。購置高質量、高純度熒光素二抗。⑵抗體以外血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成份結合。⑶組織抗原封閉不全。除去檢驗抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原，可與組織中特異性抗原以外之之對應抗體結合。延長血清封閉時間。⑷從組織中難于提純抗原性物質，所以制備免疫血清中往往混雜一些抗其它組織成份抗體，以致輕易混同。⑸抗體分子上標識熒光素分子太多，這種過量標識抗體分子帶過多陰離子，可吸附于正常組織上而展現(xiàn)非特異性染色。⑹熒光素不純、標本固定不妥等。⑺一抗和二抗孵育條件和濃度不適當。調整一抗和二抗孵育條件和濃度至最正確。⑻一抗和二抗孵育后清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長清洗時間。-3-2112免疫組化和熒光專家講座第12頁陰性染色產生原因有⑴一抗和