4、雙鏈DNA復制的分子機制（以大腸桿菌為例）

雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段4、雙鏈DNA復制的分子機制1(1)雙鏈的解開一些概念：

DNA的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。常用ori(或o）表示。許多生物的復制原點都是富含A、T的區段。大腸桿菌染色體DNA以及真核生物的細胞器DNA為雙鏈環狀，只有一個復制原點，而真核生物染色體DNA是線性雙鏈分子，含有許多復制起點。從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子（基因組獨立進行復制的單位）。(1)雙鏈的解開一些概念：2復制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態，分別作為模板，合成其互補鏈(DNA雙鏈的解開還需DNA拓撲異構酶Π、SSB),在原點處形成一個眼狀結構，叫復制眼。

DNA復制進行時，在眼的兩側出現兩個叉子狀的生長點(growthpoint)，叫復制叉。在復制叉上分布著各種與復制有關的酶和蛋白因子，它們構成的復合物稱為復制體（replisome）復制叉復制叉復制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶3復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’3’5’DNA的雙向復制復制叉起點復制叉延伸延伸起點領頭鏈領頭鏈隨后鏈隨后鏈3’5’4（2）RNA引物的合成

引發體在復制叉上移動，沿模板鏈5’3’的方向移動，與復制叉移動的方向相同，識別合成的起始位點，DnaB蛋白活化引物合成酶。引發RNA引物的合成。領頭鏈先引發開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板（3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物鏈。領頭鏈開始合成后，隨后鏈也開始合成其引物。引物長度約為幾個至10個核苷酸，在引物的5’端含3個磷酸殘基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3’端為游離的羥基。RNA引物的合成稱為“引發”。引發是一個十分復雜的過程，已經證明大腸桿菌、枯草桿菌和淋巴細胞等DNA的復制的引發需要一種稱為“引物體”（primosome)的RNA合成系統。引物體是由引物合成酶和另外的幾種蛋白質共同組成的。它可以沿模板鏈向分叉的方向前進，并斷斷續續地引發生成后隨鏈的引物RNA短鏈。引物RNA一般只含少數核苷酸殘基（原核生物約為100個核苷酸，真核生物約為10個核苷酸左右）。（2）RNA引物的合成引發體在復制5（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖核苷5’-三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行領頭鏈和隨后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

領頭鏈隨后鏈岡崎片段半不連續復制岡崎模型（3）DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種脫氧核糖6在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個添加與模板堿基順序互補的脫氧核苷酸單位以完成岡崎片段或完整鏈的合成。然后通過DNA聚合酶Ⅰ的5’至3’的外切酶活性將RNA引物上的核苷酸單位逐個除去。每個核苷酸單位被切除后立即被與模板鏈相應位置堿基互補的脫氧核苷酸補上。這后一反應是利用前面的岡崎片段作為引物通過DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性完成的。在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，在引物的3’-端逐個添加與模板堿基7領頭鏈—在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續合成的鏈。隨后鏈—在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向相反，形成許多不連續的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈。半不連續復制—在DNA復制時，領頭鏈是連續合成的,而隨后鏈的合成是不連續的，這種復制方式稱為半不連續復制。發現（1968）：同位素實驗，3HdT

短時間內為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當用DNA連接酶的變異株時，檢測到大量DNA片段的積累。——證明DNA復制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠遠大于合成DNA的一半。由于U替代dT，被尿嘧啶-N-糖基酶切除。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，檢測到一半3H標記出現在小片段（岡崎片段）中。領頭鏈—在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續8岡崎片段在DNA復制過程中，領頭鏈能連續合成，而隨后鏈只能是斷續的合成53的多個短片段，這些不連續的小片段以其發現者的名字命名為岡崎片段。岡崎片段：真核生物中100-200個核苷酸（核小體的DNA單位）。原核生物中1000-2000個核苷酸（相當于一個順反子）。岡崎片段9

1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌，然后分離標記的DNA產物，發現短時間內首先合成的是較短是DNA片段，接著出現較大的分子。一般把這些DNA片段稱為岡崎片段。進一步研究證明，岡崎片段在細菌和真核生物中普遍存在。細菌的岡崎片段較長，約有1000-2000個核苷酸；真核生物的較短，約為100-200個核苷酸。岡崎等最初做的實驗不能判斷DNA鏈的不連續合成只發生在一條鏈上，還是兩條鏈都如此。后來進行了大量的實驗證明，在DNA進行復制時，一條鏈是連續的，另一條鏈是不連續的。也就是說，聚合酶沿復制叉移動時，模板鏈為3’至5‘的一條鏈是連續合成的，而模板鏈為5’至3‘的一條鏈是不連續的。人們就將這種復制方式稱為半不連續復制。

由于DNA復制酶系不易從DNA模板上解離下來，因此前導鏈的合成總是連續的。但由于很多因素可影響到前導鏈的連續性，例如模板鏈的損傷、復制因子和底物的供應不足等，都會引起前導鏈復制中斷并從另一新點起始。1968年岡崎等用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大10（4）切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段（復制終止）

當新形成的岡崎片段延長至一定長度，其3’-OH端遇到上一個岡崎片段時即停止合成。復制叉移動到終止區即停止復制（大腸桿菌有一個終止區）。這時會發生一系列變化：在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈；修復摻入DNA鏈的錯配堿基；以修復方式填補終止區50-100bp的空缺。這樣以兩條親代DNA鏈為模板，各自形成一條新的DNA互補鏈。結果是形成了兩個DNA雙股螺旋分子。（4）切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段11

連接是DNA連接酶的作用：各岡崎片段通過DNA連接酶相互連接最終形成后隨鏈。DNA連接酶催化一個DNA鏈的5’-磷酸根與另一個DNA鏈的3’-羥基形成磷酸二酯鍵，但是這兩個鏈必須都與同一個互補鏈結合，而且兩個鏈必須是相臨的，反應需要能量。

12DNA復制體的結構：DNA合成的生點，即復制叉上，分布著各種各樣于復制有關的酶和輔助因子，它們在DNA鏈上形成離散的復合體，彼此配合，進行高度精確的復制，這異結構稱為復制體（replisome)。這種復制體于細胞內存在的一般游離體（例如核糖體)不同，復制體只是于復制叉DNA特殊結構相結合的蛋白質復合物。就現在所知，涉及DNA復制過程的酶和蛋白質因子共有30多種。右圖為復制體的最主要成分和復制的過程示意圖解。圖中DNA復制叉上進行的基本過程包括：雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA倆的延長；切除RNA引物，添補缺口，連接相臨的DNA片段；切除和修復摻入DNA鏈的脫氧尿苷酸和錯配堿基。DNA復制體的結構：DNA合成的生點，即復制叉上，分布13雙鏈DNA復制的分子機制課件14雙鏈DNA復制的分子機制課件155、真核DNA的復制：真核細胞DNA結構相當復雜，有關DNA復制的研究主要來自原核生物。但近年來，由于一些新技術的應用和體外復制系統的建立，真核細胞DNA的復制研究也有了較大進展。在真核細胞中也發現了岡崎片段、RNA引物、DNA連接酶和各種有關DNA螺旋分子解旋的酶和蛋白質。因此，真核細胞DNA的復制的過程可能十分相似于原核細胞DNA的復制。但兩者相比，主要又下列不同之處：①真核細胞DNA的復制叉有多個起始點，即具有多個復制叉來完成，并且常是雙向延長。而原核細胞常具一個復制叉。②真核細胞的岡崎片段較小，常為100-200個核苷酸；引物也較小，約為10個核苷酸。③真核細胞DNA復制的速度比原核生物慢，基因組比原核生物大。然而真核生物DNA上有多個復制點，所以復制的總速度可能比原核生物更快。④真核細胞的DNA在全部復制完成之前，起點不再從新開始復制，而在快速生長的原核生物，起點可以連續發動復制。⑤DNA聚合酶的作用有差別。原核具有3種聚合酶，真核具有4（或5）種聚合酶，且除了聚合酶δ外都不具有外切酶活力。⑥真核細胞線性染色體的末端DNA稱為端粒（telomere）。端粒的復制由一種特殊的酶——端粒酶（telomerase）所催化。端粒酶是一核糖核蛋白，它由RNA和蛋白質連種成分組成。端粒酶最早于1985年在四膜蟲細胞中發現，現知該酶在所有真核細胞中都可能存在且具有相似的結構和功能。5、真核DNA的復制：真核細胞DNA結構相當復雜，有關DN16復制叉復制叉終止區端粒結構3535端粒結構端粒酶是含RNA的逆轉錄酶復制叉復制叉終止區端粒結構3535端粒結構端17

DNA復制的其它方式大腸桿菌雙鏈環狀DNA的復制（一個復制起點，雙向復制）真核細胞線狀染色體DNA的復制方式（多個復制起點，雙向復制）單向滾環式復制（噬菌體X174DNA—單鏈環狀）3

D-環式復制方式（線粒體雙鏈環狀DNA：兩條鏈的復制起點不同位置，且復制不同步）DNA復制的其它方式大腸桿菌雙鏈環狀DNA的復制（一個復制18總之，DNA復制分子機制的基本特點是：1、復制是半保留的。2、復制起始于細菌或病毒的特定部位，真核生物有多個起始點。3、復制可以朝一個方向，也可以向兩個方向進行，后者更為常見。4、復制時，DNA的兩條鏈都從5‘端向3’端延伸。5復制時半不連續的，前導鏈時連續合成的，后隨鏈時不連續合成的，即先合成短的岡崎片段，再連接起來構成后隨鏈。6、岡崎片段的合成起始于一小段RNA引物，這一小段RNA以后被酶切除，缺口由脫氧核苷酸補滿后再與新生DNA鏈連接在一起。7、復制有多種機制，即使在同一個細胞里，也可因環境——酶的豐富程度、溫度、營養條件等的不同而具有不同的起始機制和鏈延長的方式。總之，DNA復制分子機制的基本特點是：19（二）反轉錄作用（RNA指導下的DNA合成）以RNA為模板，即按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，這與通常轉錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為反向轉錄，又稱為逆轉錄（revrsetranscription)。催化逆轉錄的酶，即RNA指導的DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），最初是在致癌病毒中發現的。

1970年，Temin，Mizufani和Baltimore分別從致癌RNA病毒中發現逆轉錄酶(reversetranscriptase),這就有力地證明了Temin的前病毒學說（provirustheory）：即致癌RNA病毒的復制需經過一個DNA中間體（即前病毒），此DNA中間體可部分或全部整合（integration）到細胞DNA中，并隨細胞增殖而傳遞至子代細胞，細胞的惡性轉化就是由前病毒引起的。前病毒學說的一個關鍵，即是認為遺傳信息可以從RNA傳遞給DNA。在此傳遞過程中需逆轉錄酶。該酶催化的反應需要模板和引物，此外還需要適當濃度的二價陽離子（鎂或錳）和還原劑（以保護酶蛋白中的巰基）；合成的方向也是5‘至3’。逆轉錄酶是一種多功能酶，它有三種酶的活力：1、它可以利用RNA作模板，在其上合成出一條互補DNA鏈，RNA-DNA雜種分子（RNA指導的DNA聚合酶活力）；2、還可以在新合成的DNA鏈上合成另一條互補DNA鏈，形成雙鏈DNA分子（DNA指導的DNA聚合酶活力）；3、它尚有核糖核酸酶H的活力，專門水解RNA-DNA雜種分子中的RNA，可沿3‘至5’和5‘至3’兩個方向起核糖核酸酶的作用。逆轉錄過程的發現，有助于人們對RNA病毒致癌機制的了解，并對防止腫瘤提供了重要線索。（二）反轉錄作用（RNA指導下的DNA合成）20+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+病毒RNA的逆轉錄過程

（以前病毒形式引起整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉化）

單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉錄酶逆轉錄酶

逆轉錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導的DNA聚合酶活性

DNA指導的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’和3’5’兩個方向起核酸外切酶的作用。逆轉錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿5’3’方向合成DNA，并要求短鏈RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+逆轉錄酶逆轉錄酶21cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA,當加入寡聚dT作為引物時，mRNA就可作為模板，在逆轉錄酶催化下在體外合成與其互補的DNA，稱為cDNA。逆轉錄酶發現的理論和實踐意義：不能把“中心法則”絕對化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉錄酶已經成為研究這些學科的工具。1983年，發現人類免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus,HIV）,感染T淋巴細胞后即殺死細胞，造成宿主機體免疫系統損傷，引起艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）cDNA：幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段po22（三）DNA的損傷修復DNA的損傷：DNA在復制時產生錯配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，破壞DNA的雙螺旋結構。從而影響DNA的復制，并使DNA的轉錄和翻譯也跟著變化，因而表現出異常的特征（生物突變）。若DNA的損傷或錯配得不到修復，會導致DNA突變。其主要形式：一個或幾個堿基被置換插入一個或幾個堿基一個或多個堿基對缺失

DNA的損傷修復——

四種修復途徑:光復活、切除修復、復組修復和誘導修復（亦稱暗修復）。（三）DNA的損傷修復23雙鏈DNA復制的分子機制課件24

光復活：400nm左右的光激活光復活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上TT（CCCT）二聚體。（包括從單細胞生物到鳥類，而高等哺乳動物無）切除修復：將DNA分子中的受損傷部分切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。（發生在DNA復制前）重組修復

（發生在復制后）：復制時，跳過損傷部位，新鏈產生缺口由母鏈彌補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸稀釋。P349誘導修復：造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應（SOSresponse）。此過程誘導產生切除修復和重組修復中的關鍵蛋白和酶，同時產生無校對功能的DNA聚合酶。所以會有2種結果：修復或變異（進化）。

25

紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，這種二聚體是由兩個胸腺嘧啶堿基以共價鍵連接成環形丁烷的結構而形成的，如右圖。其他嘧啶堿基之間也能形成類似的二聚體。但數量有限。嘧啶二聚體的形成，影響了DNA的雙螺旋結構，使其復制和轉錄功能均受到阻礙。細胞內具有一系列起修復作用的酶系統，可以除去DNA上面的損傷，恢復DNA的正常雙螺旋結構。目前已經知道體內有兩大修復系統，即無差錯修復系統和有差錯修復系統。紫外線照射可以使DNA分子中同一條鏈相臨的兩個261、無差錯修復系統：此中修復系統可使受損傷的DNA完全得到修復，恢復原有的結構和功能。主要包括光復活修復（photoreactivationrepair）和切除修復（excisionrepair）。（1）光復活修復：早在1949年即已發現光復活現象。稍后一些時間就了解到光復活的機制是可見光（大約在400nm）激活了光復活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復活作用是一種高度專一的修復方式，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體。該酶在生物界分布很廣，從低等的單細胞生物到鳥類都有，而高等的哺乳類卻沒有。這說明在生物進化過程中該作用逐漸被暗修復系統所取代，并丟失了這個酶。（2）切除修復：也稱為暗修復，即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復正常結構的過程。這是一種比較普遍的修復機制，對多種損傷均能起修復作用。參與切除修復的酶主要有：特異的核酸內切酶、外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶。1、無差錯修復系統：此中修復系統可使受損傷的DNA完全得到修27

修復過程包括四個步驟：即識別、切除、修復合成、連接（或者是識別、修復合成、切除、連接），如右圖。識別：專一性的核酸內切酶在靠近二聚體（或其他損傷處）處切斷單鏈DNA。修復：DNA聚合酶利用完整的互補鏈為模板，在斷口處進行局部的修復合成。切除：5‘-核酸外切酶切去含二聚體（或其他損傷）的寡核苷酸片段。連接：DNA連接酶在提供能量的基礎上將新合成的DNA鏈與原來的DNA鏈連接在一起。修復過程包括四個步驟：即識別、切除、修復合成、連接28雙鏈DNA復制的分子機制課件292、有差錯修復系統：在這種修復系統中，受損傷DNA并不因修復而除掉損傷部位，但隨著修復的進行，受損傷DNA的濃度越來越低，從而消除損傷的影響。主要包括重組修復（recombinationrepair）和SOS修復（SOSrepair）。（1）重組修復：重組修復是發生在DNA復制后的一種修復系統。在復制時，受損傷部位可被跳過，結果在子代鏈在損傷相對應處留下一缺口，這種遺傳信息有缺損的子代DNA分子可通過遺傳重組而加以彌補，即從完整的母鏈上將相應核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，然后用再合成的序列來補上母鏈的空缺（如右圖）。此過程稱為重組修復，因為發生在復制之后，故又稱為復制后修復。2、有差錯修復系統：在這種修復系統中，受損傷DNA并不因修復30雙鏈DNA復制的分子機制課件31（2）SOS修復：前面介紹的DNA損傷修復功能可以不經誘導而產生，然而許多能造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應（SOSresponse）。SOS反應包括誘導出現的DNA損傷修復效應、誘變效應、細胞分裂的抑制以及溶原性細菌釋放噬菌體等。細胞的癌變也可能與SOS反應有關。

SOS反應是細胞DNA受到損傷或復制系統受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現的應急反應。SOS反應誘導的修復系統包括避免差錯的修復（errorfreerepair）和傾向差錯的修復（errorpronerepair）兩類。光復活、切除修復能夠識別DNA的損傷或錯配堿基而加以消除，在它們的修復過程中并不引入錯配堿基，因此屬于避免差錯的修復。SOS修復能誘導切除修復和重組修復中某些關鍵酶和蛋白質的產生，使這些酶和蛋白質在細胞內的含量升高，從而加強切除修復和重組修復的能力。此外，SOS反應還能誘導