藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與篩選第1頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基因靶標(biāo)1、在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋藥物靶標(biāo)

（1）表達(dá)序列標(biāo)志(expressedsequencetag,EST)數(shù)據(jù)庫(kù)（2）歸納邏輯設(shè)計(jì)程序第2頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測(cè)序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個(gè)完整基因的一小部分,在數(shù)據(jù)庫(kù)中其長(zhǎng)度一般從20到7000bp不等,平均長(zhǎng)度為360±120bp。EST來(lái)源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫(kù),因此EST也能說(shuō)明該組織中各基因的表達(dá)水平。首先從樣品組織中提取mRNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下用oligo(dT)作為引物進(jìn)行RT-PCR合成cDNA,再選擇合適的載體構(gòu)建cDNA文庫(kù),對(duì)各菌株加以整理,將每一個(gè)菌株的插入片段根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行兩端一次性自動(dòng)化測(cè)序,這就是EST序列的產(chǎn)生過(guò)程。第3頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月IdentificationofPD-relatedgenes第4頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286Quantitativereal-timeRT-PCRofupregulatedordownregulatedgenesrandomlyselectedfromthelibrariesofhumannormalSN(黑質(zhì))andPD'sSN第5頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016ImmunohistochemicalstainingforTHandalpha-tubulinintheSNofanMPTPmicemodelTHalpha-tubulin第6頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Copyrightrestrictionsmayapply.CelldeathactivityofdifferentiallyexpressedgenesinPDUpregulatedgenesDownregulatedgenes第7頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基因靶標(biāo)2、基因芯片技術(shù)（1）普通基因芯片（2）ChIP-DSL

（couplingChIPwithaDNAselectionandligationstrategy），染色質(zhì)免疫沉淀/DNA選擇連接技術(shù)第8頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基因芯片的概念現(xiàn)已泛化到生物芯片（biochip）、微陣列（Microarray）、DNA芯片（DNAchip），甚至蛋白芯片。第9頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月INH(異煙阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarrayhybridizationanalysis.用INH處理INH敏感的結(jié)核菌株(紅:INH處理的;綠:INH未處理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.

用INH處理INH耐藥的結(jié)核菌株用乙硫異煙胺處理INH耐藥的結(jié)核菌株第10頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TemporalprofileofINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.第11頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RolesofINH-inducedgenesinthecontextofaproposedpathwayformycolicacid(結(jié)核環(huán)脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.

第12頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TheChIP-DSLschemePNAS2007;104（2):4852-4857

第13頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

第14頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

第15頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基因靶標(biāo)3、基因敲除（knock-out)技術(shù)第16頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luoetal.,StemCells2010第17頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Zhangetal.,JNeurosci2010第18頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基因靶標(biāo)4、檢測(cè)報(bào)告基因把靶基因表達(dá)的調(diào)控序列與編碼某種酶活性的基因相連轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),通過(guò)簡(jiǎn)單地檢測(cè)酶活性的變化,就可以反映化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)的作用性質(zhì)和程度。這種能間接反映基因轉(zhuǎn)錄水平的編碼某種酶活性的基因稱(chēng)為報(bào)告基因。第19頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月StructureofSB247464Science.1998;281(5374):257-259

第20頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ActivityofG-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)andSB247464

inNFS60cellluciferaseassaysScience.1998;281(5374):257-259

第21頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464

orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259

第22頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.1998;281(5374):257-259未轉(zhuǎn)染受體轉(zhuǎn)染CSF受體第23頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464

invitro.GranulopoieticactivityofSB247464

invivo.Science.1998;281(5374):257-259第24頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、基因靶標(biāo)5、低等生物功能基因組篩選第25頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

DrugentryrouteintoC.elegans(秀麗隱桿線蟲(chóng))NatRevDrugDiscov2006;5:387-398第26頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月TheserotonergicsynapseofC.elegans.NatRevDrugDiscov2006;5:387-398第27頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月OverviewoftheRNAinterferencesupportedtargetidentificationprocessNatRevDrugDiscov2006;5:387-398第28頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398第29頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398第30頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核糖核酸靶標(biāo)1、核酶技術(shù)

第31頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

核酶(ribozyme)

核酶:用于描述具有催化活性的RNA,即化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸(RNA)，卻具有酶的催化功能。

第32頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

核酶的發(fā)現(xiàn):1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜蟲(chóng)的26SrRNA前體加工去除基因內(nèi)含子時(shí)獲得一個(gè)驚奇的發(fā)現(xiàn)∶內(nèi)含子的切除反應(yīng)發(fā)生在僅含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)。第33頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

核酶的證實(shí)為了證明這一發(fā)現(xiàn)，他們將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細(xì)菌中并在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26SrRNA前體分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒(méi)有任何蛋白質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象稱(chēng)為自我剪接(self-splicing)，這是人類(lèi)第一次發(fā)現(xiàn)RNA具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性，具有這種催化活性的RNA稱(chēng)為核酶。ThomasCech因發(fā)現(xiàn)了核酶而獲得1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。第34頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雞的卵清蛋白基因初始RNA轉(zhuǎn)錄物的剪接

第35頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酶種類(lèi):發(fā)卡狀核酶錘頭狀核酶I型內(nèi)含子核酶RnaseP核酶丁型肝炎病毒核酶第36頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RelativegrowthrateofstrainsexpressingribozymeswithDTAsequencesasthe3′exonNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141第37頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核糖核酸靶標(biāo)2、反義寡核苷酸

第38頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,asON)人工合成的，與靶基因或mRNA某一區(qū)段互補(bǔ)的核酸片斷，可以通過(guò)堿基互補(bǔ)原則結(jié)合于靶基因/mRNA上,從而封閉基因的表達(dá)。包括：反義DNA，反義RNA，其來(lái)源可有人工合成和體內(nèi)表達(dá)兩類(lèi)。

第39頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

反義寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一種研究基因功能的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因（或疾病基因）的抑制劑，因此反義寡核苷酸模擬了藥物的作用，這功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的反義寡核苷酸本身還可以被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為反義寡核苷酸藥物。第40頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Table1.

PS-ODNstargetingtheM.tuberculosis30,32A,and32Bprotein(分枝酰基轉(zhuǎn)移酶)genetranscripts

mRNAtarget5'

3'PS-ODN5'

3'30-kDaprotein

30:1–24AATCTTTCGGCTCACGTCTGTCAT

30:HP2/HP1GCGCATATGCGCAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATGCGCGCGC

30:1–24-MMAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtT

30:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTGCGCGCGC32A-kDaprotein

32A:1–24ACGAACCCTGTCAACAAGCTGCAT

32A:HP2/HP1GCGCATATGCGCACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATGCGCGCGC

32A:1–24-MMAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtT

32A:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtGAtCCaTGcCAgCAtGCaGCtTGCGCGCGC32B-kDaprotein

32B:1–24TCGCACCTGTTCGAAGAACGTCAT

32B:HP2/HP1GCGCATATGCGCTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATGCGCGCGC

32B:1–24-MMTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtT

32B:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTGCGCGCGCPS-ODNs:antisensephosphorothioateoligodeoxyribonucleotides;MM:錯(cuò)配的核苷酸HPS-ODNs:5`-,3`-hairpin-modifiedPS-ODNs發(fā)夾修飾的反義寡核苷酸第41頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月InhibitionofM.tuberculosisgrowthbyantisenseHPS-ODNsspecificforthe30/32-kDaproteingenecomplex.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204第42頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月SpecificinhibitionofproteinsynthesisbyantisenseHPS-ODNs.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204第43頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Inhibitionof30,32A,and32BproteingenetranscriptsynthesisProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204第44頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HPS-ODNinhibitionofM.tuberculosismultiplicationinhumanmacrophagesProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204第45頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核糖核酸靶標(biāo)3、RNA干擾技術(shù)

第46頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)＋CHSGene矮牽牛花(Jorgensen,R,1990)CHS:與色素合成相關(guān)的酶,以加深花的顏色第47頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)（C.elegans)(AndrewFire,1998)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA線蟲(chóng)，果蠅微生物，植物

失敗的原因:在合成反義RNA時(shí)存在技術(shù)問(wèn)題,用于注射的正義和反義RNA中都混有少量雙鏈RNA第48頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNADicer:是一種核酸酶,將雙鏈RNA降解成21-23bp的小干擾RNARISC:RNA誘導(dǎo)的沉默小體,他是由單鏈siRNA與一些蛋白形成的復(fù)合體第49頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA干擾(RNAinterference,RNAi)RNAi是將一段雙鏈的RNA序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會(huì)受到抑制,甚至表達(dá)受到完全抑制第50頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Luoetal.,StemCells2010第51頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DecreasedhumanMKexpressioninPC-3cellstransfectedwithvarioussiRNAsCancer.2006;107(4):864-873

MK:肝素結(jié)合細(xì)胞因子第52頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EffectoftreatmentwithMKsiRNAcombinedwithPTX(紫杉醇)onPC-3cellviabilityandanchorage-independentgrowthCancer.2006;107(4):864-873

PTX:siRNA-SCR:亂序siRNS第53頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DeterminationofasuitabledoseandthedurationofthesiRNAtodownregulateMKinPC-3xenograftsCancer.2006;107(4):864-873

第54頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AntitumoreffectofMKsiRNAinPC-3xenografts.Cancer.2006;107(4):864-873

第55頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)1、抗體和胞內(nèi)抗體

第56頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第57頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗體除對(duì)組織和細(xì)胞中特異性抗原進(jìn)行定位外，尚有強(qiáng)大的中和能力阻斷蛋白質(zhì)功能。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的靶分子，需要以合適的方式將抗體導(dǎo)入細(xì)胞。顯微注射是一種將抗體注入細(xì)胞的方式，但是這種方式難以做到高通量，影響了藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證的速度。為了滿足高通量研究的需要，Moris創(chuàng)建了一套化學(xué)試劑方法將抗體導(dǎo)入細(xì)胞，而抗體的功能和細(xì)胞的活性不受影響。另一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞的方式是讓抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(intrabodies)，其中包括使用滅活病毒的方法。第58頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Abispecific,tetravalentintradiabodyJBiolChem.2003;278(48):47812-47819第59頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月IntrabodyandTie-2/VEGF-R2colocalizationonHUVECJBiolChem.2003;278(48):47812-47819第60頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A,kineticsofsurfaceexpressionofTie-2andVEGF-R2aftergenetransferoftheintradiabodyandconventionalscFvintrabodiesonHUVECusingrecombinantadenoviruseswithanMOIof10B,genetransferofintrabodiesdirectedtohumanTie-2,VEGF-R2,orTie-2/VEGF-R2byrecombinantadenovirusesonday6afterinfectionJBiolChem.2003;278(48):47812-47819第61頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Inhibitionofcapillarytubeformationinvitro

JBiolChem.2003;278(48):47812-47819

第62頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)2、生色團(tuán)輔助激光滅活(chromophore-assistedlaserinactivation,CALI)

第63頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CALl能夠直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行操作，而不是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)量的變化進(jìn)行檢測(cè)。將標(biāo)記有孔雀綠染料的非功能滅活抗體與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行激光照射。染料受激光激發(fā)短暫的產(chǎn)生活性分子，對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)造成破壞而起到滅活作用，但不影響其他蛋白質(zhì)組分。第64頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月AlentiviralsystemforsimultaneousknockdownandrescuewithafunctionalEGFP-fusioncomplement.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707第65頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CALIofEGFP-CPinducestheformationofdorsalrufflesandfilopodiaonlyintheknockdown/rescuebackground.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707第66頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CALIofEGFP-CPinKDRcellsgeneratesalocalincreaseinbarbedendsofactinfilamentsanddorsalF-actin.

ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707第67頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月CALIofEGFP-MenainMena/VASP-deficientcellsinducesmorestablelamellipodialprotrusionsProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707第68頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)3、蛋白質(zhì)組技術(shù)

第69頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因基因是一段DNA（脫氧核糖核酸分子）雙鏈。－堿基成對(duì)出現(xiàn):ATCGGCCTAGCCGG第70頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)中的信息流中心法則（TheCentralDogma）第71頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)翻譯第72頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次一級(jí)結(jié)構(gòu)

-氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

-主要由氫鍵穩(wěn)固的局部構(gòu)象，如-helix,-sheet等三級(jí)結(jié)構(gòu)

-三維構(gòu)象四級(jí)結(jié)構(gòu)

-多個(gè)多肽鏈的組合第73頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖形描述分子表面

-分子可視化

-分子對(duì)接

-基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)

-…第74頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來(lái)自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。第75頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)問(wèn)題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得第76頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定第77頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)二維電泳：蛋白質(zhì)提取樣品前處理一向等電聚焦二向SDS—PAGE凝膠銀染及掃描雙向電泳分析軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)普分析生物信息數(shù)據(jù)查詢(xún)、建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)第78頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。第79頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可溶性樣品

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級(jí)處理通過(guò)采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡(jiǎn)單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。第80頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類(lèi)、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)。第81頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月增加樣品溶解性的手段變性劑：通過(guò)改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過(guò)變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開(kāi)更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。第82頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過(guò)高會(huì)使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。第83頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣品中核酸的去除對(duì)電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過(guò)超速離心來(lái)去除復(fù)合物。第84頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專(zhuān)業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（W/W）。第85頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月特殊樣品的制備

低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離。現(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

第86頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽(yáng)極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專(zhuān)門(mén)水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。第87頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月垂直板凝膠電泳裝置加樣樣品遷移方向第88頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的一個(gè)帶孔膠粒。混合樣品帶孔膠

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子第89頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源第90頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片第91頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。

相對(duì)遷移率第92頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月水平式電泳裝置電泳緩沖液凝膠第93頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B.等電聚焦電泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下沿電場(chǎng)方向在凝膠內(nèi)制造一個(gè)pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。凝膠中加有兩性電解質(zhì)溶液（pH9-3）

加電場(chǎng)后在凝膠內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)定pH梯度

加樣品，然后繼續(xù)電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布第94頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月等電聚焦電泳進(jìn)行過(guò)程中等電聚焦電泳結(jié)束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pH第95頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月C.雙向電泳第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS

雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。第一向電泳：等電聚焦電泳聚焦后凝膠放置在SDS凝膠上，進(jìn)行第二向電泳第二向電泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3第96頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片第97頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切

包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過(guò)程第98頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程樣品制備與IPG膠條水化IPG電泳與上樣緩沖液浸潤(rùn)SDS轉(zhuǎn)PVDF膜膠內(nèi)直接染色染色取出蛋白點(diǎn)胰酶等消化濃縮于多孔吸附柱上MALDI-MS肽指紋圖數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)蛋白質(zhì)鑒定已知反向HPLC分離MALDI-MS，PSD片段分析示知ESI-MS-MS、微測(cè)序第99頁(yè)，課件共108頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計(jì)算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)）肽質(zhì)量檢索：片1.ppt

未解析碎片離子檢索：片2.ppt酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略第