第五章

體內藥物分析1.取樣2.鑒別3.檢查4.含量測定5.檢驗報告工作程序

藥品檢驗工作的基本內容完整的生物樣品分析過程樣品分析過程時間分配示意圖樣品采集樣品前處理分析測定數據處理報告結果常用體內樣品的制備與貯藏

1體內樣品分析的前處理

2體內樣品分析方法與方法驗證

3體內藥物分析定義體內藥物分析是指體內樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝或內源性生物活性物質的定量分析。體內藥物分析的定義體內樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝產物或內源性生物活性物質的定性、定量分析。體內樣品——確定分析對象藥物、代謝產物、內源性生物活性物質——確定待分析物定性、定量分析——如何選擇分析手段、建立方法并驗證體內·藥物·分析原料藥純度高

干擾少容量分析為主制劑主藥一或多

輔料干擾多儀器分析為主體內藥物成分復雜

干擾眾多

濃度很低高靈敏度

高選擇性的方法分析意義與體內藥代動力學研究和臨床治療藥物監測密切相關，直接關系到藥物的體內作用機制探討與質量評價和藥物臨床使用的安全、有效與合理。分析樣品種類血液尿液唾液頭發臟器組織其它特殊樣品?

體內樣品的種類體液組織排泄物血液;唾液;腦脊液;胃液;膽汁;乳汁;精液;淚液尿液糞便;汗液胃;腸;肝;腎;肺,腦;肌肉;頭發分析目標藥物在體內的某些代謝產物常具有一定的生理活性,它們在體內的變化規律對母體藥物的藥理學與毒理學評價特別重要.機體內源性生物活性物質往往參與機體重要的生理過程,其變化規律的異常改變也與某些疾病的發病機制密切相關母藥藥物特有代謝產物體內內源性生物活性物質第五章體內藥物分析分析對象人動物鼠兔犬大鼠小鼠男女等等猴猩猩都是一些志愿者也有一些不知情的人須動物管理與使用委員會同意分析對象藥物在體內的形態游離型代謝產物游離型原藥結合型原藥結合型代謝產物情形極為復雜綴合物分子間力結合化學共價結合稱為兩類體內藥物分析對象和待測物特點★成分復雜、干擾眾多生物基質的干擾——蛋白質、糖、脂肪、離子……其他藥物的干擾——卡馬西平治療癲癇的有效血藥濃度為3~8μg/ml，潛在中毒濃度為12μg/ml。病人可能之前用過其他抗癲癇藥物如丙戊酸鈉、乙琥胺等。代謝產物與原型藥物互相干擾——抗抑郁藥米氮平方法選擇性要高體內藥物分析對象和待測物特點★采樣量小，濃度很低常見的生物樣品采樣量少，特定條件采集，不易重新獲得

血漿：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml濃度為ng/ml~μg/ml數量級血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品方法靈敏度要高體內藥物分析方法的特點★對分析方法的要求高：滿足靈敏度及專屬性的要求樣品需要經過前處理，才能分析分析工作量大，方法驗證要求嚴格，測試數據處理和結果闡明較為復雜1.概述體內樣品分析方法色譜及其聯用方法免疫學方法生物學微生物學方法HPLC,GC,HPLC-MS,HPLC-MS/MS,GC-MS,GC-MS/MS放射（RIA）熒光（FIA）酶（EIA）適合小分子及代謝物，蛋白質大分子藥物等生物大分子藥物分析抗生素分析體內藥物分析的任務定性分析——藥物代謝產物、內源性物質是什么定量分析——血漿、組織、尿液藥物及代謝物濃度藥物代謝與動力學（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新藥研發治療藥物監測（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——臨床應用內源性物質檢測——疾病標志物社會事件中的分析——食品安全、法醫毒物分析等1.概述體內藥物分析的任務：DMPK藥代動力學研究涉及藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄等動態過程，需要研究血藥/組織濃度－時間曲線的變化，探討藥物分布與藥理作用的關系。藥物代謝與動力學血藥濃度-時間曲線尿藥累積排泄曲線生物等效性評價絕對生物利用度相對生物利用度代謝途徑代謝酶……體內藥物分析的任務：TDMTDM即測定血液中或其它體液中藥物濃度，觀察臨床藥物反應，考察藥物治療效果，必要時根據藥動學原理調整給藥方案。方向是實現個體化給藥，目的為臨床合理用藥服務，達到最佳的藥物治療效果。治療范圍中毒范圍無效范圍C最大耐受濃度最小有效濃度治療藥物監測血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40>40藥理及

毒性反應有效血藥濃度眼球震顫運動失調精神異常抗癲癇藥苯妥英鈉血藥濃度與藥理作用及毒性反應患者女性，25歲，因癲癇強直陣攣性發作入院，遂靜脈注射負荷劑量苯妥英鈉800mg并開始口服維持劑量250mg/d。測得苯妥英鈉的濃度為3.6μg/ml，醫生考慮到尚未達到治療濃度范圍，故增加劑量到400mg/d?；颊叱霈F痙攣等類似癲癇發作癥狀。測得血藥濃度為10.9μg/ml，醫生擬打算再次增加劑量?；颊甙椎鞍诪?0g/L(正常范圍是34~48g/L)，于是建議檢查患者游離苯妥英鈉濃度。結果顯示游離苯妥英鈉濃度為4.9μg/ml（游離藥物治療濃度范圍1~2μg/ml），判定患者苯妥英鈉中毒，建議降低劑量為250mg/d。體內藥物分析的任務：內源性物質檢測體內內源性物質如氨基酸、激素、兒茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。機體正常生理條件或機體發生病變：測定體內內源性物質或疾病標志物的含量，疾病的輔助診斷或及早預防。藥物（中藥）代謝組學研究體內藥物分析的中心任務體內藥物分析方法學研究生物樣品預處理方法分離分析實驗條件的優化選擇考察體內分析方法的靈敏度、專屬性、準確度、線性范圍等為臨床藥理學、臨床藥學等相關學科提供專一、靈敏、準確、快速、簡便的體內藥物分析方法。第一節常用體內樣品的制備與貯藏常用樣品的種類:(一)血樣:藥物在體內主要依靠血液運輸,血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的指標.

①血漿(plasma)

②血清(serum)③全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度，藥物代謝物及其代謝途徑、類型、速率等的研究；臨床上用于判斷患者是否違反醫囑用藥。其它：頭發、組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便。常用樣品的種類采集方法1、血液（blood）——血漿、血清和全血——體現藥物濃度和治療作用之間的關系。

——最常用的生物樣本。

（1）血樣的采集：注射器、毛細管眼眶采血、靜脈插管手術、滯留針股靜脈取血

動物實驗時，采血量不宜超過動物總血量的十分之一。（2）血樣的制備：

測定血中藥物的濃度，通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。①

血漿（plasma）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min血漿置含抗凝劑試管中抗凝劑：

肝素（最常用）、EDTA、椐櫞酸鹽、草酸鈣、氟化鈉。②

血清（serum）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min置無抗凝劑試管中37oCor室溫放置30~60min撥去血餅血清

血漿比血清的分離快，而且制取的量約為全血的50%~60%，血清只為全血的20%~40%，多數研究者用血漿進行分析測定。③全血（wholeblood）的制備靜脈血置含抗凝劑試管中保持血漿和血細胞的勻相狀態全血

血樣主要用于藥物動力學、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監測。——最常用的生物樣本。體內樣品種類與采集血液自然凝結加抗凝劑離心離心全血上層：血清serum（比血漿少纖維蛋白原）（40%）下層：血細胞（凝塊）上層：血漿

plasma（50%）下層：血細胞血樣Blood一般在給藥后的不同時間點采集血樣血清比血漿只是少一種纖維蛋白原

C血漿=C血清血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的20%~40%），多數用血漿進行分析。若血漿中含有的抗凝劑對藥物濃度測定有影響時，則應使用血清樣品

血漿與血清的區別總結血液=血漿+血細胞血漿=血清+纖維蛋白原+凝血因子血細胞=白細胞+紅細胞+血小板

血液：流動在心臟和血管內的不透明紅色液體。主要成分為血漿、血細胞血漿：血漿是血液的重要組成部分，呈淡黃色液體血清：血清，指血液凝固后，在血漿中除去“纖維蛋白”而得到的淡黃色透明液體2、唾液（saliva）--腮下腺-舌下腺--頜下腺

一些藥物的唾液藥濃(S）與血漿游離藥濃（P）密切相關，因此：——TDM中利用對S的測定代替對P的監測——藥代動力學的研究采集方法苯妥英鈉的Cs/Cp比值恒定（1）唾樣的采集：

在潄口后15min，安靜狀態下采集口腔內自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)。物理法(口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等)化學法(將檸檬酸或維生素C等置于舌尖)棄去初始部分后采集刺激法的優點——縮短采樣時間——減小唾液pH波動（pH≈7.0）——S/P的個體差異?。?）唾樣的制備——唾樣采集后，立即測量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測定或冷凍保存。采集方法1:尿液特點量大；非創傷性；尿液中藥濃度較高。2:尿液缺點食物飲；水影響；排汗。3:尿液性質淡黃色；成人日量1-5L；pH4.8-8.0；加防腐劑貯存。4:采集方法采集24h尿液：8時排尿棄去，立即服藥，尿液收集容器中，次日8時最后一次收集；分段收集5:腎功影響藥物的排泄

尿藥濃度與血藥濃度相關性差；有些難收集（如小孩）。尿液動物試驗中用代謝籠收集尿、糞，只能以時間段采集，有時會有收集不到的情況。尿藥濃度變化大，應測定一定時間內排入尿中藥物的總量。尿樣測定多用于藥物排泄、生物轉化研究。2023/6/1441優點容易獲得，屬非損傷性取樣，且樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結構的首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。

缺點與血藥濃度不相關，難以反映藥物作用過程；受腎功能、pH影響；難以定時定量取樣，易污染；所含成分復雜，已知其中有紫外吸收的化合物就達數十種。2023/6/1442組織采集：先取各種組織，應用勻漿器均勻化制成水性基質勻漿液，再以適當方法萃取。組織樣品要經過蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、堿水解：將組織水解掉酶水解：應用酶將組織水解掉其它：頭發等組織樣品藥物在組織中的分布提供重要的體內動力學過程組織常用提取方法：（1）勻漿化法（簡單，回收率低）（2）沉淀蛋白法（簡單，回收率低）（3）酸水解或堿水解（適合于酸堿條件下穩定的藥物或毒物）（4）酶水解法（避免高溫降解，不適合堿性條件下水解的藥物或毒物）2023/6/1444實例：以下可采取哪種樣品提取方法：1）利多卡因在肝臟中的組織分布？2）阿司匹林在心臟中的組織分布體內樣品貯存與處理冷藏與冷凍去活性-20℃到-80℃,低溫終止酶的活性其它方式去除酶的活性，防止樣品進一步代謝分解樣本量大，分析時間長，要保證藥物不變質，須貯存與處理1．血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏，-70℃加入穩定劑NaF2．尿樣

①尿中水、無機鹽、尿素等細菌的生長，4℃保存

②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣冷凍與冷藏去活性去活性：為防止酶進一步分解體內待測組分，采樣后必須終止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷凍法、微波照射法、勻漿及溶淀，加酶活性阻斷劑、抗氧化劑、樣品煮沸等。第二節、體內樣品的前處理體內樣品的前處理是體內藥物分析中極為重要的環節,也是分析中最困難、最繁復的工作。請先看如下處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調節pH選擇性溶劑提取RIA殘渣化學衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法預處理的目的使待測藥物游離滿足測定方法要求改善分析環境藥物進入體內后有多種存在形式，進行預處理使之游離出來，便于測定藥物或代謝藥物的總濃度體內樣品介質組成復雜，干擾很多，而待測藥物組分濃度很低，進行預處理可以分離濃集樣品。防止儀器的污染、劣化，提高測定的靈敏度和選擇性。不同的儀器及分析方法對樣品有不同的要求，須處理。常用體內樣品預處理方法去除蛋白質方法分離與富集方法微透析技術綴合物水解化學衍生化萃取如何進行？蛋白質的去除加入與水混融的有機溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有機破壞

(硝酸-高氯酸消化)分離、純化與濃集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解劑法(硝酸-高氯酸消化)常用體內樣品預處理方法去除蛋白質方法加入與水混融（親水性）的有機溶劑（乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃）。溶液的介電常數下降，蛋白質分子間靜電力增加而聚集；親水性溶劑使蛋白質水化膜脫落而析出沉降，并使與蛋白質以氫鍵及其它分子間作用力結合的藥物析釋放出來。

溶劑沉淀法混比1：2~3，

冷凍離心蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μlB加入甲醇600μlC渦旋混合3min后D10000rpm離心10min后56沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8鎢酸鹽-硫酸3.399.799.899.9100.0(飽和)硫酸銨21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀劑的用量及沉淀蛋白的百分率*：樣品渾濁，妨礙準確測定去除蛋白質方法混比1：2，

冷凍離心加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)，使溶液的離子強度發生變化，部分蛋白質的電性被中和，蛋白質的分子間排斥力減弱而凝聚；同時中性鹽使蛋白質水化膜脫落而析出沉降。中性鹽析法去除蛋白質方法混比1：0.6，

冷凍離心加入強酸(10%三氯醋酸、6%高氯酸等)，影響蛋白質等電點及開成不溶性鹽而沉降。強酸沉降法去除蛋白質方法熱變性蛋白質離心煮雞蛋？熱凝固法（1）優點：①與雜質分離②簡便③濃集④提取率高（2）提取率：在有機相與水相中的溶解度的比值分配系數，一般少量多次，對生物樣品一般一次萃取，>70%重現性分離與濃集液液萃取LLE利用藥物在有機溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度而提取（3）影響提取率的因素①pH：堿性藥物在堿性pH，酸性在酸性pH②提取溶劑相似相溶原理沸點低，不影響檢測,性質穩定，不起化學反應(化學惰性）③離子強度加入中性鹽增加離子強度，與水結合強，便于有機溶劑提取分離與濃集對于離子性特強，水溶性極大的藥物，可采用離子對提取①原理：在體液(水溶液)中呈離解狀態的酸性或堿性有機藥物(Q)，與呈相反電荷離子(X)作用形成具有一定脂溶性的離子對(QX)，再用有機溶劑提取②應用測定堿性藥物——用烷基磺酸鹽

（RSO3-）作為反離子

如戊~辛烷磺酸鈉、月桂磺酸鈉等測定酸性藥物——用烷基季銨類化合物

（R4N+·X-）作為反離子

如氫氧化四乙基銨、四丁基銨、四辛基銨等分離與濃集液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶劑充分渦旋混合3min液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準確取出上層有機溶劑置另一干凈具塞玻璃離心管置N2下水浴揮干溶劑殘留物用流動相溶解離心后進樣HPLC分析便于純化與富集示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測（液液萃?。┤∧蛞?ml，置于5ml離心管中，加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮氣流下揮干取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入100μl0.1mol/lNaOH，混勻后加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮氣流下揮干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺

體液中呈陰離子狀態的藥物主要有磺酸類、羧酸類及代謝物葡萄醛酸苷等。

體液中能離解成陽離子的藥物主要是有機胺類，尤其是季銨類藥物離子對提取應用的藥物固相萃取SPE是目前使用相當廣泛的一種萃取方法，惜乎價格較貴將不同填料作為固定相裝入小柱，藥物溶液通過小柱時，藥物被吸附、分配、離子交換，或其它親和力作用，使藥物及內源性物質同時被保留在固定相上，再選用適當溶劑洗脫藥物的方法這方面，美國是老大分離與濃集用有機溶劑(甲醇)沖洗——洗凈用水沖洗——活化上樣用水或緩沖液沖洗，洗去內源性物質有機溶劑洗脫藥物收集洗脫液······分離與濃集方法好價格貴固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去多余甲醇1)活化固相萃取基本操作1)活化2)上樣液體樣品內源性物質其他外源性物質待測藥物固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：水，由低到高比例的甲醇內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的干擾，待測藥物仍然保留在SPE柱上內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗脫劑內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑洗脫溶劑固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測藥物直接進樣分析

濃縮后進樣分析待測藥物洗脫溶劑1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫固相萃取基本操作內源性物質其他外源性物質待測藥物淋洗溶劑洗脫溶劑活化上樣淋洗洗脫①固相選擇樣品1ml1ml規格固相1~25ml3ml規格固相②固相處理反相C18

固定相的6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化

6~10倍水緩沖服液沖洗達分離狀態③上樣④分離用適當的弱溶劑洗滌洗去雜質，通N2干燥固相⑤洗脫待測物改變pH或極性固相萃取具體步驟（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1

洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉

2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過載突破性試驗已知濃度樣品液

①小體積上柱→洗脫回收百分率

②加大體積→洗脫回收百分率

③繪圖當回收率下降時為過載固相萃取具體步驟超濾分離法是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離介質的一種膜分離技術，選用不同的孔徑的不對稱膜，即可按照分子量大小進行分離適合TDM血樣分析Therapeuticdrugmonitoring綴合物的水解酶水解法酸水解法溶劑解法化學衍生法why?某些藥物或者代謝產物極性大，揮發性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生HowforGC?硅烷化?；榛粚ΨQ化常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等；

常用的?；噭阂宜狒⒈狒?；

硅烷化試劑：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅咪唑（TMSI）等。why?某些藥物或者代謝產物極性大，揮發性低，或者對檢測器不夠靈敏，難以滿足常規HPLC及GC檢測的需要，因此進行衍生HowforLC?UVFL非對映衍生化?化學衍生法非對映衍生化?對映體：一個化合物的兩個光學異構體，其分子在整體上互為不能重疊的鏡像。分子量、分子式完全相同。應用普通色譜方法難以分離。通過衍生可以使之非對映化。根據構象等理化性質差異進行分離?；瘜W衍生法分析方法的建立方法的選擇色譜分析法免疫分析法生物學方法第三節體內樣品分析方法與方法驗證分析方法的建立選用何種方法進行體內藥物分析為好呢？一般要根據藥物的理化性質、結構持征、藥物濃度大小、干擾成分的多少、預處理方法、實驗目的以及實驗室條件等因素綜合起來進行考慮。分析方法的設定依據

(一)做好文獻總結、整理工作對已有報道的藥物進行測定，應系統總結前人的文獻，從中找出哪些問題已解決，還存在哪些問題等。對尚無文獻報道的，也可根據藥物的性質情況，參考相似類型藥物的文獻資料。(二)充分了解待測藥物的特性與體內狀況藥物的理化性質和體內過程是建立方法的主要依據。藥物的理化性質包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩定性等，這些性質與分析方法的選擇、實驗條件的改善密切相關。與常規分析方法不同，體內藥物分析的對象是來自生物體內的樣品，因此對藥物在體內的狀況必須了解，如藥動學參數、體內代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔，分析方法的選擇等。(三)明確測定的目的、要求應了解擬建立的方法是用于測定藥代動力學參數，還是用于臨床藥濃監測。前者要求具有一定的靈敏度和準確度，不強調簡便、快速，設計方法時應考慮到不同時間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監測，則要求方法簡便、快速。另外，是否要求同時測定母體藥物和代謝物，若需同時測定兩者，則應選擇具有分離能力或專屬的測定方法。

（四）結合實驗室條件根據實驗室現有的和可能獲得的設備條件加以考慮，選擇可行的方法。

方法建立的一般實驗步驟

方法初步擬定后，還需進行一系列實驗工作，以選擇最佳實驗條件及驗證所擬定的方法是否適合實樣檢測。通常包括下列步驟：（一）以純品進行測定取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測定，求得濃度與測定響應值之間的關系，進行線性范圍、最適測定濃度、檢測靈敏度、測定最適條件(如pH值、溫度、反應時間等）等的選擇。(二)空白樣品測定取空白生物樣品，按擬定的方法進行處理，測定空白值(或色譜圖)。空白值高低或色譜圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性，應力求將空白值降低。在色譜分析中應力求減少體內樣品中內源性雜質峰，對無法消除的內源性雜質峰應設法使其從待測物的色譜區域內移開。能否取得良好的樣品空白實驗結果，是決定測定方法實際可行性的重要環節，必須設法解決。

(三)以水代替空白樣品，添加標準后測定以水代替空白生物樣品，添加標準后按擬定的方法進行測定，以了解提取回收率及最低檢測濃度的大致情況，從而對萃取溶劑、pH值、揮發濃縮等條件進行選擇。(四)空白樣品中添加標準后測定于空白生物樣品中添加一定量標準品后按擬定方法進行測定，求得樣品回收率數據，建立標準曲線。若采用色譜法測定，多數情況下需要用內標法定量，則應首先選擇合適的內標，然后進行回收率的測定。

(五)體內實際樣品測定經過上述(一)至(四)步驟后進行實際樣品的測定。但要指出的是，以上步驟只是生物樣品實樣檢測前的準備工作，不能完全確定是否適用于實樣測定。因藥物在體內變化是復雜的，如不注意藥物代謝和蛋白結合情況，則應用體外建立的方法，進行體內實樣測定時往往會失敗，甚至導致錯誤的結論，所以在設計方法時強調對藥物體內過程要有一定程度的了解，從而選擇避免干擾和適合樣品實際情況的方法。有時也可采用專屬性強，已證明用于體內實樣測定的步驟和方法作為對照測定，以此來檢驗所建立的方法的實際可行性。

分析方法的建立方法

的驗證特異性標準曲線與定量范圍定量下限準確度與精密度穩定性回收率分析過程的質量控制未知樣品濃度超出范圍的處理相關物質測定其它方法驗證驗證的效能指標與基本要求

1．特異性——內源性物質不得干擾原藥、代謝物 2．標準曲線與線性范圍——r≥0.9900，至少5個濃度，不許外延 3．準確度——與實際狀況相符 4．精密度——結果可重現 5．定量限——達到峰濃度的1/10～1/20,3~5倍t1/2， 6．穩定性——確保所有樣品準確測定 7．提取回收率——一般低于100％，須穩定(一)特異性

比較標準物質與6個不同個體的空白生物介質和QC樣品軟電離質譜(LC-MS)介質效應比較QC樣品和至少6個不同個體用藥后的實際樣品必要時LC-DAD/MS確證峰的單一/同一

比較待測藥物,同服藥物,待測藥物的QC樣品和添加有同服藥物的干擾樣品特異性(specificity),又稱專屬性或專一性,通常與選擇性(selectivity)互用1.內源性物質2.未知代謝物

3.伍用藥物4.參比方法參比方法橫坐標(x),擬定方法縱坐標(y),最小二乘y=a+bx

a恒定干擾b比例干擾(如,標記抗原不純,交叉免疫)(二)標準曲線與定量范圍1.標準曲線的建立(二)少數方法(如,IA)外,通常為線性模式

線性回歸:最小二乘法或加權最小二乘法自變量(x)為藥物濃度,因變量(y)為響應信號強度(1)系列標準溶液:

n≥6(不包括0點);等比系列(2~3); 通常為100~1000倍(2)內標溶液:

濃度相當于系列標準溶液的幾何平均濃度

(3)系列標準樣品:空白生物介質,加入系列標準溶液(4)標準曲線的繪制:藥物濃度,以單位體積(如血漿)或質量(如肝臟)的生物介質中加入標準物質的量表示(二)標準曲線與定量范圍2.限度要求通常用至少6個濃度建立標準曲線非線性相關(如IA)可能需要更多濃度點定量范圍覆蓋全部待測樣品濃度范圍定量上限(ULOQ)高于用藥后的峰濃度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)標準曲線各濃度點的回歸計算值(x’)與標示值(x)之間的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范圍之內最低濃度點的偏差在±20%以內其余濃度點的偏差在±15%以內(三)定量下限1.測定法取同一生物介質,制備至少5個獨立的標準樣品,其濃度應使信噪比(S/N)大于5,依法進行精密度與準確度驗證定量下限(LLOQ):標準曲線上的最低濃度點符合準確度和精密度要求2.限度要求準確度應在標示濃度的80%~120%范圍內,相對標準差(RSD)應小于20%(四)精密度與準確度1.測定法高中低3個濃度的QC樣品,制備至少5個獨立的樣品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:幾何平均濃度同法獨立測定3天

方法精密度除評價批內(日內)RSD外,同時還應評價批間(日間)RSD2.限度要求準確度:低,80%~120%; 中高,85%~115%RSD:低,20%; 中高,15%(五)穩定性1.測定法(高低濃度)室溫考察1個工作日(如1,2,4,8或24h)

冷藏(4℃)數個工作日(標準儲備液至整個分析完成)冷凍(-20℃/-80℃)至整個分析完成凍-融至少經歷3個循環

短期穩定性:在1個分析批內,樣品室溫等待處理;處理后溶液在特定(HPLC進室)溫度等待進樣期間穩定性長期穩定性:在整個樣品分析期間,體內樣品的長期儲藏,凍融;以及標準儲備液的穩定性2.期限要求短期:通常1工作日,不超過3工作日;長期:整個分析完成期限(六)提取回收率1.測定法高中低3個濃度的QC樣品,制備至少5個獨立的樣品另取空白生物介質,照QC樣品同法處理,加入等量的標準溶液(必要時除去溶劑)同法處理高中低3個濃度的標準對照樣品(不含生物介質)樣品處理方法的評價重點在于結果的精密與重現;而非待測物提取的完全與否2.限度要求RSD:低,20%; 中高,15%(七)分析過程的質量控制每個未知樣品測定一次,必要時進行復測來自同一個體的體內樣品在同一分析批中測定每個分析批,建立批標準曲線;并隨行3濃度QC樣品

QC樣品每個濃度至少雙樣本,并均勻分布在未知樣品順序(低→高/高→低順序均勻穿插整個分析批)中一個分析批內未知樣品數目較多時,應同時增加各濃度QC樣品數,使QC樣品數大于未知樣品總數的5%QC樣品測定結果的偏差不大于±15%,低濃度點偏差不大于±20%;允許1/3非同濃度QC樣品結果超限不符合上述要求,則該分析批樣品測試結果作廢(八)未知樣品濃度超限的處理標準曲線不能外延,濃度超限的樣品處理后再測定濃度高于ULOQ部分樣品用空白生物介質稀釋至規定體積再測定同時制備濃度高于ULOQ的QC樣品,同法稀釋(濃度不低于LLOQ)后測定濃度低于LLOQ增加樣品體積(制備樣品濃度高于LLOQ);同法進行QC樣品和空白介質試驗特異性不降低,準確