高效液相色譜法第一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法是20世紀70年代發展起來的一項高效快速的分離分析技術.液相色譜法是指流動相為液體的色譜技術.在經典的液體柱色譜法的基礎上,引入了氣相色譜法的理論,在技術上采用了高壓泵(一般在150-350×105Pa),高效固定相和高靈敏度(ng,pg級)的檢測器,實現了分析速度快,分離效率高和操作自動化.第二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二主要特點:

高壓:一般在150-350×105Pa

高速:一般在1h之內完成分析高效:GC2000塔板/米;LC30000塔板/米高靈敏:

10-9gng

10-11gpg第三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

HPLC的原理及特點HPLC的主要類型及其分離原理HPLC的固定相選擇

HPLC的流動相選擇HPLC儀器及評價HPLC的應用第四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜原理ConcentrationinPhaseAConcentrationinPhaseBKD=第六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜原理高效液相色譜是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次的交換過程，它借助溶質在兩相之間的分配系數、親和力、吸附能力、離子交換、分子大小引起的排阻作用等差別使不同溶質進行分離（分離條件）。分離過程受溶質在兩相的擴散系數、固定相填料的顆粒大小、填充密度、流動相組成及流速等因素影響。流動相固定相第七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜原理--分離過程ISDC第八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜參數--保留值保留時間

tR

保留體積VR=tRF,死時間

tM

調整保留時間t`R=tR-tM

調整保留體積V`R=t`RF

第九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜參數--容量因子、選擇性、相對保留值容量因子k`==K=物質在固定相上的量qs物質在流動相上的量qmVsVmtR-t`RtM相對保留值a=t`R(2)t`R(1)

選擇性a`==tR(2)tR(1)

1+k`(2)1+k`(1)(a`-1)=(a-1)k`(1)1+k`(1)第十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜參數--柱效h=h0exp{-}(t–tR)222理論塔板數N=()2

tRN有效=N()2k`1+k`H有效=H()2

1+k`k`第十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二色譜參數—分離度和分離效能總指標R=

2{tR(2)-tR(1)}W1+W2K1=

2{tR(2)-tR(1)}W1/2(1)+W1/2(2)R=0.59K1其它參數：譜帶擴張和滲透性第十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二提高柱效—改變色譜峰的寬窄提高選擇性—改變色譜峰的間距第十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

高效液相色譜法的原理及參數

HPLC分類

HPLC儀器及評價

HPLC的應用常見問題及注意事項第十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二體積排阻色譜(SizeExclusionChrom.)反相色譜(ReversedPhaseChrom.)離子交換色譜(IonExchangeChrom.)疏水作用色譜(HydrophobicInteraction)親和色譜(AffinityChrom.)金屬鏊和色譜(ChelatingChrom.)第十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二SizeExclusion

Chromatography常用填料：硅膠、甘油基丙基鍵合、交聯葡聚糖或瓊脂糖、甲基丙烯酸酯等。主要公司：Merk,Pharmacia,Tosoh,Waters,Synchrom…(SEC,GFC,GPC)第十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二SizeExclusionChromatography

Buffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:No主要用于：測定分子量；目標蛋白的純化，脫鹽等.柱的選擇：能夠分離相對分子量的上下限為:100-800000，孔徑等30KD50KD第十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二IonExchangeChromproteinBProtein

BproteinBProtein

BProtein

AProteinANa+SO3+--CM常用填料：磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、表面改性硅膠等…分類：陽離子交換、陰離子交換第十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二IonExchangeChromBuffer:PBS+NaClTris-HCl+NaClGradient:Yes柱的選擇：當溶質在pH一定的流動相中帶正電荷，

選用陽離子交換柱，否則用陰離子交換柱影響因素：鹽的類型，離子強度，pH影響選擇性和分離度resin-O-(CH2)2-NH+

--NCH3+CH2CH3CH2CH3resin-O-CH2-COO-resin-O-(CH2)3-SO3-第十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二IonExchangeChrom第二十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二Affinity

Chromatography基質配基目標產物填料：基質---纖維素、凝集素、交聯瓊脂糖或葡萄糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃…配基---抗體、凝集素、酶、抑制劑、抗生素、配位體…第二十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二AffinityChromatographyUVabsorbanceFreeligandconcentration柱的選擇：根據被分離目標產物的特點選擇合適的色譜柱，重要是配基。影響因素：配基容易被雜質污染，柱子的壽命短，樣品須前處理。主要用于純化較為昂貴的蛋白，抗體等。Buffer:含有可以與基質上的配基結合物的溶液Gradient:Yes第二十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二HydrophobicinteractionChromatography

proteinsurface---+++-nonpolarnonpolar填料：基質：有機聚合物（交聯瓊脂糖、乙烯聚合物、TSK-PW）和大孔硅膠鍵合相配基：苯基、戊基、丁基、羥丙基、乙基、聚乙二醇、芐基等H3C-C-N-C-O-H3C-C-N-C-O-NHOH3C-C-N-C-O-NHOONH第二十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二decreasingsaltconcentrationUVabsorbanceHydrophobicInteractionChromatography柱的選擇：根據被分離目標產物的疏水性選擇合適的色譜柱，基質和配基的類型是關鍵。影響因素：鹽的種類，離子強度，溶液的pH以及溫度對疏水作用都影響較大。Buffer:

常用：(NH4)2SO4,PBS,pH4~8Gradient:Yes第二十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ReversedPhaseChromatography反相色譜是指流動相的極性大于固定相的分離體系，其分離機理主要基于溶質與固定相疏水作用的差別填料：基質：硅膠配基：

C18,C8,C4,Phenyl硅膠硅膠第二十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ReversedPhaseChromatography柱的選擇：根據被分離目標產物的疏水性及分子大小選擇合適的色譜柱。C18穩定性高，有效孔徑小，對分離蛋白容易產生不可逆吸附。影響因素：流動相的組成，溶液的pH以及溫度。第二十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ComparisonbetweenRPCandHIC

RPCHIC分離機理強疏水性弱疏水性配基C18,C8,C4,Phenyl

復雜流動相有機相，水相，梯度蛋白的分離容易失活失活<10%

常用于分析可用于制備可分離物

范圍較大相對較小操作方式

高壓常壓第二十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ComparisonbetweenRPCandNPC正相色譜-流動相的極性小于固定相的分離體系；機理-被分離化合物的極性基團與固定相的極性基團相互作用；流動相-非極性的有機溶劑加入極性的有機溶劑；分離-異構體，易水解，在極性溶劑中溶解度小的物質。反相色譜-流動相的極性小于固定相的分離體系；機理-被分離物的與固定相的疏水相互作用力的差別；流動相-極性的有機溶劑或水；分離-范圍最廣。RPCNPC第二十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二液相色譜固定相1、液液色譜法及離子色譜法固定相全多孔型擔體表面多孔型擔體

化學鍵合固定相

Si-O-CSi-O-Si-CSi-CSi-N

Si-O-Si-C化學鍵穩定，耐水、耐熱、耐有機溶劑，第二十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二化學鍵合固定相具有的特點：1）表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質快。2）無固定液流失，增加了色譜柱的穩定性和壽命。3）可以鍵合不同官能團，能靈活的改變選擇性4）有利于梯度洗滌，有利于配用靈敏檢測器和餾分的收集第三十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二2液固吸附色譜法固定相

硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等3離子交換色譜法固定相

薄膜型離子交換樹脂

離子交換鍵合固定相

陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性樹脂）

陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性樹脂）第三十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二4空間排阻色譜固定相

軟質凝膠葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠水為流動相

半硬質凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯共聚凝膠(交聯聚苯乙烯凝膠)適用于非極性有機溶劑,丙酮乙醇等極性溶劑不能用.

硬質凝膠

多孔硅膠多孔玻璃珠等第三十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二液相色譜流動相

GCN2H2HeLC流動相的種類,流動相的配比能顯著影響分離效果.流動相選擇:

1)流動相純度AR2)應避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑

3)對樣品要有適宜的溶解度

4)溶劑的黏度小一些為好

5)應與檢測器相匹配第三十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二常用溶劑的極性順序:

水(極性最大),甲酰胺,乙腈,甲醇,乙醇,丙醇,丙酮,四氫呋喃,甲乙酮,正丁醇,乙酸乙酯,乙醚,二氯甲烷,氯仿,溴乙烷,苯,甲苯,四氯化碳,二硫化碳,環己烷,己烷,庚烷,煤油,石油醚(極性最小).第三十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

為了獲得合適的溶劑強度(極性),常采用二元或多元組合的溶劑體系作為流動相.采用的溶劑可分為底劑及洗脫劑兩部分底劑決定基本的色譜分離,洗脫劑具有對組分選擇性分離

正相色譜中底劑采用低極性溶劑,洗脫劑選擇極性較強的溶劑.

反相色譜中底劑采用強極性溶劑(水),洗脫劑選擇極性較弱的溶劑(有機溶劑).第三十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

離子交換色譜主要在含水介質中進行,組分保留值可以用流動相中鹽的濃度和pH來控制,增加鹽的濃度導致保留值降低,由于流動相離子與交換樹脂相互作用力不同,因此流動相中離子類型對樣品組分的保留值有顯著影響.一般陰離子的滯留次序為:

檸檬酸離子＞SO4

＞草酸離子＞I＞NO3

＞CrO4

＞Br＞SCN＞Cl＞HCOO＞CH3COO＞OH＞F一般陽離子的滯留次序為:Ba

＞Pb＞Ca＞Ni＞Cd＞Cu＞Co＞Zn＞Mg＞Rb＞K＞NH4＞Na＞H＞Li第三十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二

排阻色譜法所用的溶劑必須與凝膠本身相似,才能潤濕凝膠并防止吸附.

一般情況下,

對分離高分子有機化合物采用溶劑主要是四氫呋喃,甲苯,間甲苯,苯酚,NN-二甲基甲酰胺等.

生物物質的分離主要用水,緩沖鹽溶液,乙醇及丙酮等.第三十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二HPLC分離類型的選擇

應用HPLC對樣品進行分離分析應考慮各種因素,包括樣品的性質(相對分子量,化學結構,極性,溶解度參數等化學性質和物理性質),液相色譜分離的類型的特點及應用范圍,實驗室條件(儀器,色譜柱,檢測器等)等因素.

相對分子量較低,揮發性較高的試樣適用于GC分析.

標準的LC類型(液-固,液-液,離子交換,離子對色譜,離子色譜等)適用于分離相對分子量為200到2000的試樣,而大于2000的則用空間排阻色譜.

第三十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二試樣相對分子量相對分子量大于2000小于2000不溶于水溶于水排阻色譜,水為流動相排阻色譜,非水流動相不溶于水同系物—正相或反相色譜異構體多官能團—吸附色譜分子量大小差異—排阻色譜溶于水,不離解反相色譜排阻色譜,水為流動相溶于水,可離解堿-----陽離交換色譜酸-----陰離交換色譜溶于水,離子和非離子反相離子對色譜

第三十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二toMSPressuregaugeFilterPrecolumnHighpressurepumpMixingvesselInjectionportTowasteDetectorAutosamplerAnalyticalcolumnSignalcollectionPulsedamperSolvent1Solvent2ReservoirsDegasser1VacuumpumpDegasser2第四十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二第四十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二DegasserMembraneVacuumchamberPressuresensorControllerThree-wayvalveVacuumpumpHPLCpumpEluent高效液相色譜儀單元介紹第四十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二PumpPPtt第四十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二PumptowastePurgevalveABCDtomixingchamberAB四元梯度泵--低壓混合二元梯度泵--高壓混合比例伐第四十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二Damper第四十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二Autosampler第四十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二Injectionport第四十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二DetectorConductivityDetector

UV/VisDetectorFixedWavelengthDetector

variablewavelengthdetectorPhotoDiodeArrayDetector

RefractiveIndexDetector

FluorescenceDetector

ElectrochemicalDetectorMassSpectrometryEvaporativeLightScatteringDetector

第四十八頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二UV/Vis--FixedWavelengthDetector第四十九頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二UV/Vis--variablewavelengthdetectorTheUV/Vissourceusuallycomesfromamonochromatorsothewavelengthcanbeselected,orscanned.Absorbanceincreasesaseluatepassesthroughthecell.Ifwavelengthscanningisdesired,theflowisstoppedlongenoughforthescantotakeplace.第五十頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二UV/Vis--PhotoDiodeArrayDetector第五十一頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ConductivityDetectorSensitivitiesforcompoundssuchasphenol,catecholamines,nitrosamines,andorganicacidsareinthepicomole(nanogram)Themobilephasemustbemadeelectricallyconductive,usuallybytheadditionofasuitablesalt第五十二頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二RefractiveIndexDetectorAvalveisopenedandpuresolventpassesintoonehalfofacell.Theeluateflowsthroughtheotherhalfofthecell.Thetwohalvesareseparatedbyaglassplatemountedatananglesuchthatbendingoftheincidentbeamoccursifthetwosolutionsdifferinrefractiveindex.第五十三頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二FluorescenceDetector

Shortpass-transmitsallwavelengthsbelowaspecifiedcutoffLongpass-transmitsallwavelengthsaboveaspecifiedcutoffBandpass-blocksallwavelengthsoutsideaspecifiedband第五十四頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ElectrochemicalDetectorDetectorsthatbasedonelectroanalyticalproceduresareavailable.Theyoffertheadvantagesofhighsensitivityandsimplicity第五十五頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二EvaporativeLightScatteringDetectorThescatteredlightisdetectedbyasiliconephotodiodelocatedat90oanglefromthelaser,thephotodiodeproducesasignalwhichissenttotheanalogoutputsforcollection,alighttrapislocated180ofromthelasertocollectanylightnotscatteredbyparticlesintheaerosolstream第五十六頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二OtherDetectorProgrammableDetectorsChemiluminescencedetectionRadioactivitydetectionPulsed-amperometricdetectionFT-IR第五十七頁，共六十一頁，編輯于2023年，星期二ComparisonbetweendifferentdetectorsDetectorCompoundsSensitivityUVUV/Vischromophoressuchasaromatics,aldehydes,ketones1ppbRIUniversal,allcompounds-cannotusegradientmobilephases10ppmFluorescencesugars,de