ICS65.020.300862-2018青海省地DB63方標準DB/T1699—2018青海省質量技術監督局發布IDBT699—2018前言GB/T1.1-2009給出的規則編寫。海省科學技術廳提出并歸口。協會。要起草人：吳天一、范微、徐楠、張玲、周國華、張評滸、張毓。1DBT699—2018微生物學等級及監測等要求。分適用于實驗用喜馬拉雅旱獺微生物學等級分類、質量監測和管理。規范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T14926.1實驗動物沙門菌的檢測方法GB/T14926.4實驗動物皮膚病原真菌檢測方法GBT14926.14實驗動物金黃色葡萄球菌檢測方法GBT14926.15實驗動物肺炎鏈球菌檢測方法GBT14926.16實驗動物乙型溶血性鏈球菌檢測方法Ws269-2008布魯桿菌PCR檢測方法Ws279-2008鼠疫診斷標準GBT4789.8小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗AWHV方法語和定義本標準。ExperimentalHimalayanMarmot楚，用于科學研究、教學、生產和檢定等其他科學研究的青藏高原特有種鼠喜馬拉雅旱獺。獺微生物學等級分類普通級實驗用喜馬拉雅旱獺(ConventionalMarmotaHimalayana)不攜帶所規定的人與喜馬拉雅旱患病病原和喜馬拉雅旱獺烈性傳染病病原的實驗用喜馬拉雅旱獺。4檢測指標2DBT699—20184.1外觀皮膚無缺損、無疥癬；泄殖孔清潔、正常。4.2病理解剖器無肉眼可見病理變化，如腫大、壞死灶或寄生蟲包塊等。4.3病毒。用喜馬拉雅旱獺病毒檢測項目旱獺肝炎病毒WoodchuckHepatitisVirus,WHV●4.4病原菌。驗用喜馬拉雅旱獺病原菌檢測項目●icdermalfungi●鼠疫耶爾森菌Yersiniapestis●○○tococcuspnemoniae○s○○注1：●必須檢測項目：指在進行實驗用喜馬拉雅旱獺質量評價時必須檢測的項目。5檢測程序5.1檢測動物應于送檢當日按細菌、真菌、病毒要求聯合取樣檢查。實驗用喜馬拉雅旱獺↓外觀檢查↓3DBT699—2018麻醉↓↓鼻試子、肛試子(或新鮮糞便)細菌檢查→檢測鼻試子、肛試子(或新鮮糞便)細菌檢查→檢測結果判定↓↓↓檢測報告測方法則檢測頻率旱獺病原微生物每年檢測一次。樣本采集數量量見表3。驗用喜馬拉雅旱獺病原微生物檢測樣本采集數量要求群體大小(只)100~5004DBT699—2018＞500樣本采集要求.1樣本采集的部位應按從體外到體內，從頭到尾的順序無菌操作采樣。.2樣本采集的部位決定于所檢病原菌在宿主體內外的特異性定點或病變部位。對寄居于呼吸道的原菌，通常采集鼻咽拭子或氣管分泌物。定位于腸道的病原菌，采集回盲部內容物。所采集的樣本中不混有抗菌藥物、消毒劑以及防腐劑。運輸培養基。血清樣本盡量減少溶血并在低溫下運送。樣本采集方法皮毛在動物皮毛消毒前，剪去頭、頸、腹股溝處皮毛接種于培養基。鼻咽拭子浸潤的無菌棉拭子擦拭鼻咽部分泌物。氣管分泌物7.4.3.1處死動物，仰臥固定于解剖板，剪除頸部皮毛，用碘酊和75%酒精消毒皮膚后解剖。7.4.3.2暴露氣管，于氣管中段剪一“V”形口，用無菌棉拭子朝咽部方向擦拭，或用滅菌接種環刮液吹打制成洗脫液。回盲部內容物.4.1處死動物，仰姿固定于解剖板上，剪除腹部皮毛，用碘酊和75%酒精消毒皮膚后解剖。.4.2暴露回盲部，于該處剪一“V”形口，用滅菌接種環沾取內容物。肛拭子鹽水浸潤后的無菌棉拭子插入肛門適當深度擦拭取樣。病變組織及分泌物液。結果判定該等級標準。9檢測報告告應包括檢測項目、檢測方法、檢測結果、檢查結論、檢測人員等內容。5DBT699—2018A(規范性附錄)獺肝炎病毒(WHV)的檢測方法A.1WHV核心抗體的檢測標準A.1.1方法競爭抑制法檢測。A.1.2操作流程A.1.2.1抗原的表達與純化A.1.2.1.1將轉化了pQEWHc149H的JM109菌種從-70℃取出復蘇并用2mmol/L的IPTG進行大量WHcAg誘導表達，大量誘導表達后的菌液4℃8000×g10min離心沉淀后-40℃凍存。15%SDS電泳驗證誘導的結果。蛋白過夜。00×g5min離心，留上清液-40℃凍存。A.1.2.1.4CsCl密度梯度離心：從超速離心管底部依次加入1.10g/cm3、1.20g/cm3、1.30g/cm3、1.4梯度離心后的目的蛋白用PBS進行透析，3d后取出，Bradford法測蛋白濃度，SDS電泳后分析蛋白A.1.2.2多克隆抗體的制備加強免疫1次，共免疫3次。1周后取血分離血清。A.1.2.3ELISA檢測方法的建立確定ELISA中的抗體稀釋度和待檢血清稀釋度:以0.6μg/mlWHcAg包被ELISA板，次日洗板后用Lh加入HRP標記羊抗小鼠IgG(H+L)37℃溫育45min，洗板，顯色。A.1.3結果判定于50%為陽性。A.1.4質量控制品及所有試劑均小量分裝后冷凍保存。6DBT699—2018A.2WHV表面抗原的檢測標準A.2.1方法采用雙抗體夾心法檢測.A.2.2操作流程A.2.2.1A.2.2.2A.2.2.3A.2.2.4A.2.2.5A.2.2.6A.2.2.7A.2.2.8PBS次。7℃封閉1小時，洗板同上。，37℃孵育30分鐘，洗板同上。的生物素標記抗WHs，37℃孵育30分鐘，洗板同上。HRP素，37℃孵育30分鐘，洗板同上。顯色劑A和顯色劑B，室溫避光顯色15分鐘。標儀讀取OD450。A.2.3結果判定SN值，大于2.1判為陽性。A.2.4質量控制品及所有試劑均小量分裝后冷凍保存。A.3WHVDNA的檢測標準A.3.1方法PCR測。A.3.2操作流程A.3.2.1制作標準曲線WHV序列的質粒pcDNA3.1WHV作為標準品。A.3.2.2血清DNA抽提QiagenbloodtissueDNA提試劑盒說明書操作。具體操作如下：L3)將上述所得溶液和絮狀沉淀加入到吸附柱DNeasyMini柱中(吸附柱放入收集管中)，中。7DBT699—2018n將吸附柱室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。收集到新的離心管中，放置于-20℃保存。A.3.2.3配制PCR體系如下：μL)MIXBufferPrimer1Primer22HOmerCCTCCAACTCCACCTCTAAGPrimerTTGTGTTGGCGTTCCGTTA.3.2.4PCR反應條件如