現代環境生物技術

主講教師：付保榮參考書：1.現代環境生物技術王建龍文湘華編著清華大學出版社2.現代生物技術在環境工程中的應用馮玉杰主編化學工業出版社第一章概述第一節生物技術概述一、生物技術（Biotechnology）“生物技術”一詞首先由匈牙利的KarlEreky于1917提出。他當時是指用甜菜作為飼料進行大規模養豬，即利用生物將原材料轉變為產品。

廣義：利用有機體的操作技術二、生物技術的發展可以劃分為三個不同的階段:

階段特征傳統生物技術釀造技術近代生物技術微生物發酵技術現代生物技術以DNA重組技術的建立為標志的，

已成為一門多學科縱橫交叉的新興

和綜合性技術。1．現代生物技術發展史1953年，美國生物學家沃森(Watson)和英國物理學家克里克(Crick)提出DNA雙螺旋結構分子模型。DNA雙螺旋結構的發現．標志著現代分子生物學的誕生，揭示了世界上千差萬別的生命物種個體在分子結構和遺傳機制上的統一性，并為后來以DNA重組為主要手段的基因工程奠定了基礎。1973年，美國加利福尼亞大學舊金山分校的HerberBoyer教授和斯坦福大學的StanleyCohen教授合作進行了人類歷史上第一次有目的基因重組實驗。1975年，Kohler和Milstein創立了淋巴細胞雜交瘤技術，獲得了單克隆抗體。2．現代生物技術涉及的學科基礎：生物化學、遺傳學、細胞生物學、微生物學、分子生物學、生物信息學、化學工程儀器分析：先進的儀器設備、檢測設備、分離純化設備、制造設備包括的相關領域：農業生物技術、醫藥、家畜、海洋、食品、預防、診斷、環境圖1-1現代生物技術樹形圖二、現代生物技術義3．現代生物技術定義以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎學科的科學原理，按照預先的設計改造或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。生命科學基礎：上述基礎學科先進的工程技術：基因工程、酶工程、細胞工程和發酵工程技術其他學科的科學原理：化工原理、工藝原理、微生物原理改造生物體：動物、植物、微生物加工生物原料；淀粉轉化餐盒、淀粉轉化乙醇生產所需產品：醫藥、食品、達到某種目的：預防、診斷、環境污染監測圖1—2基因工程、酶工程、細胞工程與發酵工程之間的關系4．現代生物技術內容基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程第二節環境生物技術一、環境生物技術的產生

是現代生物技術應用于環境污染防治的一門新興邊緣學科。它誕生于20世紀80年代末期，以高新技術為主體，并包括對傳統生物技術的強化與創新。環境生物技術涉從眾多的學科領域，主要由生物技術、工程學、環境學和生態學等組成。它是由生物技術與環境污染防治工程及其他工程技術緊密結合形成的，既只有較強的基礎理論，又具有鮮明的拄術應用特點。

第二節環境生物技術二、環境生物技術的定義鑒于環境生物技術是一門新興學科，因此，對環境生物技術的定義也有多種。廣義上講，凡是自然界中涉及環境污染控制的一切與生物技術有關的技術，都可稱為環境生物技術。

是直接或間接利用生物或生物體的某些組成部分或某些機能，建立降低或消除污染物產生的生產工藝或者能夠高效凈化環境污染，同時又生產有用物質的工程技術。環境生物技術

分為高、中、低三個層次

高層次：是指以基因工程為主導的現代污染防治生物技術，如基因工程菌的構建，抗污染型轉基因植物的培育等。中層次：是指傳統的生物處理技術，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理論和技術背景下產生的強化處理技術和工藝，如生物流化床、生物強化工藝等。低層次：是指利用天然處理系統進行廢物處理的技術，如氧化塘、人工濕地系統等。

三、環境生物技術的研究范圍

現代環境生物技術應用現代生物技術服務于環境保護，目前環境生物技術面臨的任務有：(1)解決基因工程菌從實驗室進入模擬系統和現場應用過程中，其遺傳穩定性、功能高效性和生態安全性等方面的問題；(2)開發廢物資源化和能源化技術，利用廢物生產單細胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用廢物生產生物能源，如甲烷、氫氣、乙醇等；(3)建立無害化生物技術清潔生產新工藝，如生物制漿、生物絮凝劑、煤的生物脫硫，生物冶金等；(4)發展對環境污染物的生理毒性及其對生態影響的檢測技術。

第二章基因工程第一節基因學說的創立一、基因的提出

(1)創世說(2)進化論(3)細胞學說（4）經典的生物化學和遺傳學孟德爾(GregorMendel)二、DNA的發現肺炎球菌的轉化實驗噬菌體侵染細菌的實驗三、DNA的結構核苷酸(nucleotide)：堿基(base)、脫氧核糖、磷酸基三部分組成

三、DNA的結構堿基：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、A=T、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)G=C

三、DNA的結構

DNA分子的骨架

三、DNA的結構DNA的雙螺旋結構示意圖

DNA的半保留復制

四、基因的結構第二節基因工程的誕生和研究內容一、理論上的三大發現

1．20世紀40年代，確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的載體是DNA而不是蛋白質，明確了遺傳的物質基礎。2．20世紀50年代，揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制，解決了基因的自我復制和傳遞問題。3．20世紀60年代，提出了中心法則，成功破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流向和表達題。圖1-6中心法則示意圖中心法則(centraldogma)

轉錄:以DNA的雙鏈中的一條為模板，按互補方式合成RNA，這種遺傳信息由DNA到RNA的傳遞過程稱為轉錄。反轉錄通翻譯:轉錄后的mRNA作為合成蛋白質的模板，并且由mRNA的堿基排列順序決定多肽鏈中氨基酸的排列順序，遺傳密碼(geneticcode)系統密碼子：組成蛋白質的氨基酸共有20種，mRNA上每三個堿基決定一個氨基酸，這種對應于氨基酸的堿基三聯體稱為密碼子。1966年，人們已將全部三個堿基組合后的密碼子全部破譯出來。遺傳密碼是通用的二、技術上的三大發現1.DNA分子的體外切割和連接技術（標志著DNA重組時代的開始）（1）限制性內切酶（2）DNA連接酶1967年2.DNA分子的核苷酸序列分析技術3.載體的使用三、基因工程的誕生1973年，Cohen等獲得了抗四環素和新霉素的重組菌落TcrNer，標志著基因工程的誕生。Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr四、基因工程的發展史1973年被認為是基因工程誕生的元年1972年，美國斯坦福大學的P．Beng領導的研究小組，在世界上第一次成功地實現了DNA的體外重組。

1973年，斯坦福大學的S．Cohen等人進行了另一重組DNA分子的實驗。1980年，P．Beng和S．Cohen獲得了諾貝爾生物學獎。美國生物化學家、現代基因工程的創始人——P·伯格四、

基因工程的發展史1977年，E.coli中合成了人生長激素基因。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達。1982年，培育出了超級鼠。1985年Horsch發明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉基因植株。四、基因工程的發展史

1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak將B.T.基因導入棉花獲得抗蟲棉。1991年，美國開始人類基因組計劃。1997年，“多利”綿羊誕生。轉移大鼠生長素基因的小鼠五、基因工程的概念1概念 按照預先設計好的藍圖，利用現代分子生物學技術，特別是酶學技術，對遺傳物質DNA直接進行體外重組操作與改造，將一種生物（供體）的基因轉移到另外一種生物（受體）中去，從而實現受體生物的定向改造與改良。

基因工程的概念--廣義基因工程：DNA重組技術的產業化設計與應用。上游技術：外源基因重組、克隆和表達的設計與構建（狹義基因工程）下游技術：含有外源基因的生物細胞（基因工程菌或細胞）的大規模培養以及外源基因的表達、分離、純化過程。genemanipulation,

genecloning,

binantDNAtechnology,geneticmodification,

newgenetics,

molecularagriculture2基本步驟：(切、接、轉、增、檢）施工材料的準備：目的基因、載體、工具酶和受體細胞（宿主）的準備。用限制性內切酶分別將外源DNA和載體分子切開。目的基因與載體DNA的體外重組，形成重組DNA分子。把重組的DNA分子引入受體細胞，并建立起無性繁殖系。篩選出所需要的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細胞中穩定遺傳、正確表達?；蚬こ痰幕静襟E3.基因工程的基本原理分子遺傳、分子生物學以及生化工程學是基因工程原理的三大基石。一個完整的基因由三部分組成：啟動子、編碼序列與終止子。利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量，借此提高宏觀表達水平。這是涉及到DNA分子高拷貝復制以及穩定遺傳的分子遺傳學原理。

基因工程的基本原理篩選、修飾和重組啟動子、增強子、終止子等基因的轉錄調控元件。選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子等mRNA的翻譯調控元件，強化受體細胞中蛋白質的生物合成過程。基因工程菌（細胞）

是現代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生物效能的基礎上，從工程菌大規模培養的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增值速度和最終數量，也是提高外源基因表達產物的主要環節。4.基因克隆需要特殊的工具和技術運輸工具：細菌質粒病毒染色體DNA操作技術純化DNA 剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子將DNA轉入受體細胞重組子的鑒定4基因工程的意義基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型。概括地講，其意義體現在以下三個方面：大規模的生產生物分子設計構建新物種搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內的遺傳信息。表1-1主要基因工程產品的研制、開發、上市時間產品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日巨人癥人胰島素1978美糖尿病1982歐人生長激素（HGH）1979美侏儒癥1985美人α-干擾素（IFN）1980美病毒1985歐乙肝疫苗（HBsAgV）1983美乙肝1986歐人白細胞介素1984美腫瘤1989歐人促紅細胞生成素（EPO）日貧血1988歐人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美5.基因工程的意義工業輕工業能源工業醫藥重組藥物基因治療檢測遺傳疾病、病原5.基因工程的意義農業抗病蟲提高品質提高花卉的觀賞價值抗逆性家畜 瘦肉比飼料利用率加快生長第三節基因工程的工具酶一、限制性內切酶（Endonucleosase）1.限制性內切酶（Endonucleosase）的發現

50年代初發現細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷，從而保證其不為外來噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護，這種現象叫做限制－修飾，它們由三個基因位點所控制：hsdR,hsdM,hsdS,十年后，人們搞清了細菌的限制與修飾分子機理：

hsdR---限制性內切酶

hsdM---限制性甲基化酶

hsdS---控制兩個系統的表達

1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株(HaemophilusInfluenzue)中分離出兩個類內切酶，HindII和HindIII，為基因工程技術的誕生奠定了基礎。

截止到目前為止，已經分離出400余種II類酶，搞清識別位點的有300種，商品化的約有一百種，而實驗室常用的有二十種。限制性內切酶（Endonucleosase）2.限制性核酸內切酶的分類：

可分為三大類

I類能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近切割雙鏈，但切割序列沒有專一性。

II類識別位點（回文序列）嚴格專一，并在識別位點內將雙鏈切斷

III類識別位點嚴格專一（不是回文序列），但切點不專一，往往不在識別位點內部。

因此在基因工程中具有實用價值的是II類限制性內切酶。3.II類限制性內切酶的命名及特性命名原則：取屬名的第一個字母大寫，取種名的前兩個字母小寫，構成基本名稱。該種中發現的不同的酶按照順序編號I,II,III等。如存在變種和品系，取變種或品系的一個字母。若酶存在于質粒上，則需大寫字母表示非染色體遺傳因子。

如，HindIII從HaemophilusInfluenzue(流感嗜血桿菌)d株中分離的第三個酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗藥性R質粒上。3.II類限制性內切酶的底物識別順序及切割位點

絕大多數的II類限制性內切酶在底物DNA上的識別順序長度為4，5，6堿基對，這些堿基對的順序呈回文結構（Palindromic），而且切點就在其內部，如EcoRI5‘-GAATTC-3’。

DNA被限制性內切酶切開之后，呈現兩種口：

鈍端（平端）如PvuII,AluI,EcoRV等

粘端（粘性末端）如：EcoRI等圖2-1限制性內切酶產生的末端4.識別位點在DNA分子中的頻率

對于特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點數目是可以計算的，四堿基的酶平均大約每256個核苷酸（44）有一個識別位點，而六堿基的酶大約4096（46）個核苷酸有一個識別序列，計算是在假定核苷酸隨機排列的情況下進行的。實踐中這種方法不完全正確，如λDNA長49kb，對于六堿基的酶應該有12個切割位點，實際上要少一些，如BglII只有6個，BamHI只有5個，而SalI只有2個。二、甲基化酶

在專一位點上甲基化，與限制性內切酶相對應。

1.大腸桿菌中的甲基化酶

dam甲基化酶:可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）則不會因為N6A的甲基化而失去活性，因為這兩種酶對底物的特異性不同。

dcm甲基化酶此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影響的限制性內切酶是EcoRII。

2.甲基化酶在基因工程中用途

許多II類限制性內切酶，都存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上，封閉酶切位點，從而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基轉移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上，從而使DNA免受EcoRI的切割。三、T4-DNA連接酶（T4-DNALigase）

來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，連接修復3'端羥基和5'端磷酸基因，脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵

連接雙鏈DNA上的單鏈缺口（Nick），因此亦可連接限制內切酶所產生的粘性末端

連接RNA模板上的DNA鏈缺口

連接平頭雙鏈DNA速度很慢，在高濃度的底物和酶的作用下方可進行，這屬于分子之間的連接.圖2-2連接酶的作用方式四、核酸酶

作用:降解磷酸二酯鍵

分為：外切酶內切酶

1.Bal31(來自于細菌Alteromonasespejiana)

單鏈特異的核酸內切酶活性，雙鏈特異的內切酶活性。依賴于Ca2+

用途：

構建限制酶圖譜

產生末端缺失突變

DNA超螺旋線性化

2.E.coli外切酶III

只降解DNA分子的一條鏈，產生單鏈的DNA分子。四、核酸酶3.S1核酸酶（來源于米曲霉菌）

特性：

(1).降解單鏈DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解的速度

(2).降解發生的方式為內切和外切

(3).酶切活性需4.0-4.5pH環境，Zn2+激活

(4).酶量過大時會降解雙鏈核酸，因為雙鏈降解活性比單鏈低75000倍4.DNaseI:來自于牛胰腺,

既可以降解單鏈也可以降解雙鏈，沒有特異性，產生單核苷酸或短鏈五、聚合酶1.DNA聚合酶I

5’-3’聚合酶活性

3’-5’外切酶活性

5’-3’外切酶活性

核酸內切酶活性

可以被枯草桿菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。

圖2-3DNA聚合酶I

五、聚合酶2.Klenow酶

該酶無5'-3'外切活性，保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性，基因工程中利用該酶：

修復限制性內切酶造成的5'突出的粘性末端

標記DNA探針

催化cDNA第二條鏈的合成

末端終止法測序

圖2-4Klenow酶的作用方式五、聚合酶3.T4DNA聚合酶

與Klenow酶相似，外切酶活性更高。體外誘變反應中效率很高。4.T7DNA聚合酶

測序酶5.TaqDNA聚合酶

耐高溫，主要用于PCR反應。

五、聚合酶6.逆轉錄酶：將mRNA轉錄成cDNA

(1)AMV逆轉錄酶（鳥類成髓細胞性白血病病毒）

DNA聚合酶活性

RNaseH活性

DNA內切酶活性

核酸結合活性

(2)M-MLV逆轉錄酶（Moloney鼠白血病病毒）兩種逆轉錄酶的區別

肽鏈的組成

禽酶2條肽鏈，具聚合酶和很強的RNaseH活性

鼠酶1條，較弱的RNaseH活性

反應的最適溫度

禽酶42°C，二級結構豐富RNA，禽酶效率高

反應的最適pH值

禽酶pH8.3

鼠酶pH7.6

六、DNA修飾酶

有大量的修飾酶，主要的有以下幾種：堿性磷酸酯酶（來自于大腸桿菌或小牛腸道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基團。

polynucleotidekinase:來自于T4侵染的大腸桿菌，在5’端增加磷酸基團。末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）來自于小牛胸腺組織，在DNA分子的3‘端增加一個或多個脫氧核苷酸。

Topoisomerase改變共價閉合雙鏈DNA分子的結構第四節DNA的切割反應

一、緩沖系統的組成

II類酶的酶活條件：Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)-HClPH7.5,25-50mM；10mMMgCl2；NaCl0-150mM；DTT(二巰基蘇糖醇)1mM

根據不同酶對鹽離子要求不同，可將緩沖液分為以下三種情況：

高鹽：100-150mM

中鹽：50-100mM

低鹽：0-50mM

二、酶切操作DNA量的確定;加入酶量的確定，反應體積的確定（20μl），反應時間的確定，1-1.5hr，一般為37℃，但也有例外，如TaqI(耐熱性DNA聚合酶，)在65°C時活性最高。單位限制性內切酶定義為：在最佳緩沖系統和20μl體積中反應1小時，完全水解1μgDNA所需的酶量例子：分子量94KD，催化5'→3'DNA合成，DNA聚合時的延伸速度是所有嗜熱DNA聚合酶中最快的，理想狀態下為2~4kb/min，可以很好地擴增10kb以下的片段。其最佳反應溫度70~75℃，dNTPs的工作濃度為100~300μM，最佳Mg2+濃度為2~3mM，最佳pH為8.1~9.1，其PCR產物含3'端單個dA，能進行T-A克隆。DNA擴增（PCR）時，20μl反應體系需1~1.5unit，50μl反應體系需2~3units。

。三、酶切結果分析

1.

酶切片段的檢測

1）通過凝膠電泳分離，根據分子量分離。根據凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子。

2）DNA分子的檢測a.染色EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠），DNA分子小于25ng，很難檢測到

GoldViewTM核酸染料

b.放射性自顯影,可以監測少到2ngDNA分子。

2.估計DNA分子的大小

根據DNA分子的遷移率，可以用公式計算出分子量D=a-b(logM)

D是移動的距離，M是分子量，a,b是恒量但隨著電泳條件的改變而改變。

也可以根據已知大小的片段進行比較，誤差約在5%左右。

四、多酶聯合酶解

對于對濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶解；

對于對濃度要求不同的酶，可以：

1.低鹽濃度的酶先切，后補加NaCl

2.一種酶切后，換緩沖液，加5mMNaAc0.1體積，2體積乙醇，冰浴5min，4℃離心10min，干燥

五、定位酶切位點

建立酶切圖譜需要一系列的酶。

首先確定每一種酶切后產生的分子量和片段的數目；

然后進行雙酶切；

比較酶切和雙酶切的結果，繪制酶切圖譜；

含糊的位點可以通過部分酶切解決，可以短時間的酶切或者在4°C條件下進行。六、限制性內切酶的star活性

在PH不合適，或甘油濃度過高≥10%時，限制性內切酶的切割位點會出現非專一性，因此應確保酶的體積為總體積的十分之一以下。

第五節DNA片段的連接一、連接方式

1.相同粘性末端的連接

來源:

相同的酶

同尾酶

問題:

極性有兩種可能

同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為“焊死”。

連接方式2.平頭末端的連接

粘性末端--分子內部連接，平頭末端--分子間的連接。

提高連接效率的方法：

加大酶用量（10倍）

加大平頭末端底物的濃度

加入10%PEG（8000），促進分子間的有效作用

加入單價陽離子，150-200mMNaCl

提高反應溫度

平頭連接同樣存在兩種極性

連接方式3.不同粘性末端的連接

突出5'末端

Klenow補平，或S1核酸酶切平，然后平頭連接

突出3'末端

T4-DNApol切平，然后平頭連接

突出末端不同

Klenow補平，或S1核酸酶切平

連接后，可能恢復限制性位點，甚至還可能產生新的位點。XbaI與HindIII（XbaI恢復），XbaI與EcoRI（均保留），BamHI與BglII（產生ClaI位點）

連接方式4.人工粘性末端的連接

5'突出的末端

外源片段先用Klenow補平；然后用TdT補加polyC；載體片段也用Klenow補平，加polyG，退火不經連接即可轉化。目的是：不使酶切位點遭受破壞。

3'突出的末端

外源片段先用TdT加polyG；載體片段加polyC；然后退火；再用Klenow補齊；連接

平頭末端

可直接用TdT補加末端，但以加polyA/T為佳。這樣稍微加熱，AT區就會出現單鏈區域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段連接方式5.粘端與平端的連接

linker:人工合成的、含有限制性內切酶識別序列的、短的雙鏈DNA片段。

–連接的效率較高

–酶切時可能破壞DNA分子的完整。

adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。圖2-5linker的連接方式

連接方式6.粘性末端的更換

在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口

–BamHI酶切片段用Klenow補平，或用S1酶切平；連接一段linker或Adaptor，使之產生EcoRI粘性末端。這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口。

–由AluI更換EcoRI：AluI切開，T4-DNApol切平，另一段DNAEcoRI切開，Klenow補平，連接，原來含有AluI的片段變成含有EcoRI二、重組率1.重組率連接反應結束后，含有外源DNA片段的重組分子數與加入的載體分子數之比。較為理想的重組率為25-75%2.提高重組率的方法

連接反應條件外源片段：載體＝2:1-10:1（分子數），增加碰撞機會，減少自身環化。

載體除磷（磷酸酯酶5’除磷）。

TdT在3’端增加人工粘性末端，防止載體自我環化。第六節載體的功能及其特征載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具。一、載體的功能1.運送外源基因高效轉入受體細胞

2.為外源基因提供復制能力或整合能力

3.為外源基因的擴增或表達提供條件二、載體應具備的條件

1.具有對受體細胞的可轉移性

2.具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點

3.長度盡可能小，以提高其載裝能力

4.具有多種單一的酶切位點

5.具有合適的選擇性標記

圖2-6自主復制型載體和附加載體的擴增方式

三、質粒質粒是存在于細菌細胞質中獨立于染色體而自主復制的共價、封閉、環狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA），并不是細菌生長所必需的，但可以賦予細菌某些抵御外界環境因素不利影響的能力。分子量在1-200kb之間。1.質粒的基本特性

（1）自主復制性

質粒DNA攜帶有自己的復制起始區（ori）以及一個控制質粒拷貝數的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制。不同的質粒在宿主細胞內的拷貝數也不同，少則幾個多則幾百個不等，當然由于質粒上并沒有復制酶的基因，所以其復制需要使用宿主細胞復制染色體DNA的多種酶群。

（2）不相容性

利用同一復制系統的不同質粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導入同一細胞中，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭，它們在單細胞中的拷貝數也會有差異，拷貝多的復制更快，結果在細菌繁殖幾代之后，細菌的子細胞中絕大多數都含有占優勢的質粒，因而這兩種質粒中只能有一種長期穩定地留在細胞中，這就是所謂的質粒不相容性。

1.質粒的基本特性（3）可擴增性

質粒就其復制方式而言分為兩類：松弛型復制及嚴謹型復制。pMB1或ColEI類質粒復制子的復制完全依靠宿主細胞提供的半衰期較長的復制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產物），因此在蛋白質合成中斷時，質粒復制能持續合成，這樣當用氯霉素抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColEI復制子的質粒將利用豐富的原料大量復制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。

但另外兩種質粒（psc101和p15A）和的復制子的復制受質粒上編碼的蛋白因子的正調節。氯霉素抑制蛋白質合成后，這類質粒便不能持續復制。（4）可轉移性

在天然條件下，很多天然質粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內轉移到另外一種宿主內，這種轉移依賴于質粒上的tra基因產物。2.質粒的構建

（1）天然存在的兩種質粒

1）colE1宿主細菌大腸桿菌6.5kb松弛型復制20-30/cell

2）pSC101宿主細菌沙門氏菌8.8kb嚴謹型復制5copy/cell標記基因為Tcr質粒的命名p小寫代表質粒；后面有兩至三個大寫字母代表發現者或構建者的姓名。

（2）質粒人工構建的目的

天然質粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構建：

1）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇

2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組

3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量

4）改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

5）根據基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件

方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。

3.質粒的分類（1）根據質粒基因編碼的特性將質粒分為五大類：

1).Fertility/F質粒：只含有tra基因，除了促進接合轉移外沒有其他功能。

2).Resistance/R質粒：含有氯霉素、青霉素或水銀抗性基因。如RP4，發現于假單胞桿菌。

3).Col質粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細菌，如存在于E.coli中的CoE1。

4).降解質粒（Degradativeplasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。

5).致瘤質粒（Virulenceplasmids）農桿菌Ti質粒

圖2-7利用抗性基因進行重組子的篩選

3.質粒的分類（2）人工構建的質粒根據其功能及用途分為:

1).多拷貝質粒復制子經過人工突變，除去控制拷貝數負調節基因，使質?？截悢颠_到每個細胞數千，用于擴增外源基因。

2).測序質粒

3).整合質粒裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上

4).穿梭質粒含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制

5).表達質粒裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內的高效表達

6).探針質粒篩選克隆或尋找基因元件，通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等。4.實驗室常用質粒

（1）pBR322

該質粒具有以下優點：

1）分子大小4363bp，容易純化。

2）含有2個抗生素抗性基因，可以作為選擇標記。而且每一個標記基因都含有單一的酶切位點，可以插入DNA，amp基因內可被PstI,PvuI,SacI切開，而四環素抗性基因可被BamHI,HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。

3）受體細胞內，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內可達到15個，而在蛋白質合成抑制劑存在條件下，可達到1000-3000拷貝，如氯霉素?？梢援a生大量的重組pBR322分子。圖2-8pBR322的結構

（2）pBR327一個多拷貝質粒

pBR327是在pBR322的基礎上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質粒的復制和接合能力。他與pBR322還要有兩點不同：

1）pBR327比pBR322有更高的拷貝，每個細胞中含有30-45個拷貝。但正常細胞中較高的拷貝數，使它適合于應用于基因功能研究。

2）剪切破壞了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接轉入其他細胞。這對生物biologicalcontainment是非常重要的（生物防范）。

圖2-9pBR327的結構

（3）pUC8—Lac選擇質粒

pUC8也來自于pBR322，但只保留了復制起點和ampR位點，ampR基因的序列已改變限制性位點不再存在，所有的克隆位點集中在lacZ’基因內的一個小片段上。

pUC8的優點：

1）突變位點位于復制起點，復制前可以使細胞中質粒的拷貝數達到500-700個，可以提高載體的產量。

2)重組子的鑒定可一步完成，固體培養基中添加amp和X-gal,IPTG，節約了一半的時間。

3）pUC8的多克隆位點，可以使具有不同粘端的DNA片段插入載體，而不必連接linker。

4）載體中的多克隆位點與M13mp系列的載體是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接轉入M13mp載體，可以進行DNA測序和體外定點突變。圖2-510pUC8的結構圖

（4）pGEM3Z-DNA的體外轉錄

pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識別位點。這兩段啟動子存在于限制性內切酶的兩端，這意味著如果在重組的pGEM3Z載體中加入RNA聚合酶，可以發生轉錄，合成的RNA可以作為探針使用，或者研究RNA的加工過程或者蛋白質的合成。

2-11

pGEM3Z載體的結構及外源DNA的轉錄4.質粒的制備

實驗室一般使用兩種方法制備質粒：

（1）堿裂解法

1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中

2）加溶菌酶裂解細菌細胞壁

3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內含物

4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質

5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質及核酸酶

6）乙醇或異丙醇沉淀水相質粒

7）無DNase的RNase處理殘余RNA

用此方法制備的質粒較純，收得率高，但繁瑣，且質粒中有開環現象4.質粒的制備（2）沸水浴法

（1）將菌體懸浮浮在含有EDTA和TritonX-100的緩沖液中

（2）加溶菌酶破細胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物

（5）乙醇異丙醇沉淀

用此法制備的質粒不純，收得率低，且制備規模小，但快速，特別適用于重組質粒的鑒定。圖2-12細菌DNA的提取

圖2-13質粒DNA提取方法圖2-14CsCl梯度離心法純化質粒DNA四、以噬菌體DNA為基礎的載體

1.λDNA載體

（1）λ噬菌體的分子生物學

λ噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和λ-DNA組成

1)λ-DNA的物理圖譜λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈（粘性末端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱為cos區，全長48.5kb。

特點:是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。例如，所有的編碼外殼蛋白的基因都聚集在左端1/3處；控制基因組整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是負責裂解宿主細胞、DNA自主復制以及調控的基因；相關基因的聚集對λ基因組的表達是非常重要的，這能夠使他們一起啟動或關閉，而不是單獨起作用。圖2-15cos位點的作用2）感染周期

噬菌體通過特殊的生物學方式感染宿主細胞，將其DNA導入

（1）吸附吸附于大腸桿菌外膜上的LamB受體（正常功能是運轉麥芽糖進入細胞內），麥芽糖可誘導這些受體的合成，故它也可促進λ噬菌體的吸附與感染（尾部吸附）。

（2）DNA注入

（3）DNA復制從單一ori區滾筒復制，形成線狀多聯體，λ-DNA上兩個基因的產物激活復制的起始，但復制所需的蛋白因子系統則由宿主細胞提供。

（4）包裝包裝蛋白在宿主細胞內合成，包裝蛋白首先結合在cos區的附近，形成包裝啟動復合物，因此cos區對包裝是至關重要的。

包裝時由一個蛋白因子將cos區切開，從而保證只有一個DNA線狀負責被保證在一起，每個宿主細胞可包裝多達100個成熟的λ-DNA分子，包裝對DNA本身的性質無關，但對其大小要求比較嚴格，它只能包裝λ-DNA分子的75%-105%，也就是說可以包裝36.4kb-50.9kb范圍內的DNA，包裝好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌體顆粒。

（5）裂解每個細胞內容納了多達100個成熟的噬菌體，這時兩種負責裂解宿主細胞的蛋白被合成，細菌細胞被裂解，成熟的噬菌體釋放出去，又去感染另外的宿主細胞，直至大腸桿菌細胞全部被裂解。圖2-16

λ噬菌體的侵染循環（2）λ－DNA載體的構建

1）λDNA分子只能增加5%的大小，意味著只能插入3kb的DNA分子。

2）λ基因組非常大，對于每一種酶來講都含有超過1個的識別序列，酶切后產生多個片段，連接不能形成λ基因組。建立λ克隆載體前需要解決2個問題

Ⅰ.

縮短長度

野生型λ－DNA包裝的上限為50.5kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實λ－DNA上約有40-50%的DNA片段是復制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。Ⅱ.修飾酶切識別位點

天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。（3）λ-DNA的抽提

1)大腸桿菌培養至對數生長期（在含有乳糖的培養基中）

2)加入λ-噬菌體或重組λ－噬菌體懸浮液，37℃培養1小時

3)用新鮮培養稀釋，繼續培養4-12小時

4)高速離心，沉淀噬菌體

5)苯酚抽提，釋放λ-DNA

6)乙醇或異丙醇沉淀DNA（4）λ-DNA作為載體的優點

1)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌

2)λ-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量

3)重組λ-DNA的篩選較為方便

4)重組λ-DNA分子的提取比質粒容易

五、考斯質粒（粘性質粒，cosmid）

1.考斯質粒的構建

λ-DNA載體的最大裝載量為25kb,有的往往需要構建克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒就是應這種需要而人工組建的。

考斯質粒顧名思義就是含有λ-DNA兩端cos區的質粒。由于λ-DNA包裝時，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，約1.5kb長。如果將這一小段DNA與質粒連在一起，則這個重組質粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時它仍可象λ-DNA一樣，被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與噬菌體DNA所不同的是，考斯質粒不能在體內被包裝，更不能裂解細胞，它的制備與質粒相同。進入細胞后，質粒上的復制子進行復制。圖3-17Cos質粒pJB8

2.考斯質粒的優越性

1)能象λ-DNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞

2)可以裝載比質?；颚?DNA大得多的外源DNA片段，如cos區及附近順序長為1.7kb，質粒長為3.3kb，則該考斯質粒最大可裝載46.5kb的外源DNA

3)由于攜帶質粒的選擇標記，便于篩選

4)由于質粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。六、M13-DNA

1.M13單鏈噬菌體的分子生物學

M13是一種線狀、單鏈DNA噬菌體，總長6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內孔將DNA注入細菌體內。單鏈DNA利用宿主細胞的復制另一條鏈（負鏈），形成雙鏈DNA（RFDNA），然后以負鏈為模板，滾筒式復制串聯式上鏈分子，當拷貝數達到100-200時，負鏈上的基于產物干擾復制，使其停止，同時，由兩條鏈上編碼的蛋白基因表達，包裝正鏈，并分泌至體外，宿主細胞不會發生裂解。細菌細胞每分裂一次，大約可以釋放1000個新的病毒顆粒。2.M13-DNA載體家族

1.M13mp載體家族

M13-DNA上幾乎沒有非必需區域，因而載體的構建主要是插入標記基因如，lacZ‘、多克隆位點，消除多余的酶切位點。在M13上引入lacZ’基因，產生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，含有6堿基的序列GCATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產生了M13mp2。M13mp2是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養基上可以很容易的區別出來。

M13載體的構建的第二步是將限制性內切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產生了M13mp7。

2.噬菌粒（Phagemid）

質粒與M13-DNA的重組體，它帶有質粒上的酶切位點及標記基因，這樣更于篩選及克隆，同時由于不含包裝蛋白基因，載體本身長度減少，裝載量增大，比質粒大，但不及λ-DNA。3.M13-DNA作為載體的優點及用途

最為顯著的優點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點誘變

（3）用于合成探針第七節重組DNA的轉化與篩選

載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：

a.未連接的載體分子

b.未連接的DNA片段

c.載體的自連

d.含有錯誤插入片段的重組DNA分子

e.重組DNA分子

轉化過程中，這些分子同時被轉移到宿主細胞內。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特殊的條件下才能復制，寄主的酶可降解這些DNA片段。自連的載體和錯誤插入的重組質?？梢赃M入宿主細胞進行正常的復制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。一、細菌的轉化方法自然界中，轉化并不是細菌獲得遺傳信息的主要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的轉化，進一步的研究發現，這類細菌含有DNA結合和吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉化效率，建立了一系列的轉化方法：

a.熱激法轉化感受態細胞

b.PEG介導的原生質體轉化

c.高壓電穿孔法轉化

d.顯微注射法轉化

e.接合轉化

f.噬菌體轉染表4—1大腸桿菌常用轉化方法的比較轉化方法轉化效率Ca誘導107-8原生質體轉化105-6噬菌體轉化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結合轉化104-5

圖4-1熱激法轉化感受態的過程1.受體細胞應具備的條件

a.限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、內切酶）

b.重組整合缺陷型RecA-（對于用于基因擴增或基因高效表達的受體）

c.具有較高的轉化效率

d.具有與重組體互補的遺傳性狀

e.感染與寄生缺陷型安全角度的要求。

2.大腸桿菌感受態的制備與轉化

轉化的突破發生在1970s的早期，研究發現，在冷的鹽溶液中轉化的效率提高。一般利用50mM的CaCl2，其他的鹽如氯化銣也有較高的效率。經過處理的細胞稱為感受態細胞。

感受態細胞(Competentcells):受體細胞經過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competentcell)。3.篩選轉化細胞

感受態細胞的轉化不是一個高效的過程，雖然1ng的pUC8可以產生1000-10000個轉化子，意味著只吸收了0.01%的DNA分子。所以必需篩選轉化細胞。1.利用抗生素的插入失活篩選轉化子

2.lacZ’基因的插入失活（藍白斑篩選）

載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調控序列和頭146個aa的編碼序列

宿主：缺失了lacZ’基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列

α-互補：lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體可以與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現互補。二、

轉化子的鑒定通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：

1限制性內切酶法：外源片段通過特定的酶切位點插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質粒，電泳分析插入片段長度是否正確。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進行鑒定

3菌落原位雜交法：將在后面的章節中提到。

4基因產物檢測法：如果使用的是表達載體，那么就可以通過鑒定基因產物的方法鑒定正確的克隆。第八節克隆基因的方法克隆基因的方法有很多，根據研究基礎的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：

1.PCR或RT-PCR法

2.從基因文庫中分離基因

3.從cDNA文庫中分離基因

4.轉座子標簽法

5.圖位克隆法

6.差減雜交法、扣除雜交、差異顯示法

7.人工合成法

一、從基因文庫中選擇基因1.基因文庫

基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數目的克隆的集合。基因文庫是通過純化細胞總DNA，然后利用特定的限制性酶酶切產生能插入載體的片段，一般是λ替換載體、粘粒或者是YAC。圖5-21基因文庫的構建過程二、PCR法1.

PCR：聚合酶鏈式反應PCR是從復雜的材料中擴增特殊DNA序列的強有力的技術。因此，除構建基因組文庫外，還可以用采用特異引物的PCR直接從基因組DNA中分離基因。然而，PCR標準條件的一系列限制是它僅對較短產物的擴增有效。PCR酶持續合成能力的不足，及它們校正能力的缺乏，加上PCR所要求的特殊的反應條件也可能對堿基造成損傷都增加了長模板中過早突變的可能性。圖2.7聚合酶鏈式反應。2.影響PCR的關鍵因素PCR的特異性關鍵是由引物決定的。以下因素對選擇有效引物很重要c1．引物長度應該在17—30個核苷酸之間。2．GC的理想含量力50％。對Gc含量偏低的引物，最好選擇較長的引物以避免變件溫度偏低。3．應該避免具有單核苷酸長重復(即大于3或4個)的序列。4．最好不采用有明顯二級結構的引物。5．兩引物之間不得互補。大部分符合這些標準的引物可以有效地參與反應，但即使在最優的條3.RT一PCR為了將PCR方法用于研究RNA及RNA樣品．必須首先經反轉錄變為cDNA．從而為熱穩定性的聚合酶提供DNA模板這個過程稱為反轉錄（RT)，進而有了RT一PCR這一名稱。人們常用鳥類成瘤病毒（AMV）或Moloney鼠白血病病毒（M一MtLv）的反轉錄酶來產生RNA模板的DNA拷貝4.實時定量PCR

Higuch5等人(1992，1993)最早開始應用溴化乙錠來對擴增的PCR產物進行定量。擴增反應產生越來越多的雙鏈DNA，它們結合溴化乙錠后會使熒光增強。用熒光增強量對循環次數作圖，可以對實時的PCR動力學進行分析。使用溴化乙錠的主要缺點是：無論是特異性的產物還是非特異性的產物都可以產生信號。要克服這個問題可通過改變探針的方法來檢測積累的產物(Livak等，1995)。人們開發出了結合了熱循環和熒光測定方法的儀器．可以對PCR的擴增過程進行實時監控。這使通過PCR來對DNA進行定量的方法發生了革命性變比。反應的特征是循環中第一次檢測到擴增產物的時刻，而不是固定循環次數后PCR產物的積累量。靶序列的原始拷貝數越多，檢測到的熒光強度也越大。對未知樣品中靶序列的定